单分子电子序列检测器及其使用方法技术

本公开提供了与单分子检测相关的装置、系统和方法。具体而言，本公开提供了用于使用电流波动作为蛋白质结合到核酸靶的读数来序列特异性检测所述核酸靶的装置和方法。如本文所述，所述生物电子装置和方法的某些方面可用于检测和识别任何核酸靶以用于诊断和/或治疗的目的。目的。目的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单分子电子序列检测器及其使用方法
[0001]政府支持
[0002]本专利技术是在由美国国家卫生研究院颁发的HG010522下借助政府资助进行的。政府拥有本专利技术的某些权利。
[0003]相关申请
[0004]本申请要求2020年2月28日提交的美国临时专利申请号63/011,799的优先权和权益，所述申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
[0005]以电子方式提交的材料以引用的方式并入
[0006]计算机可读核苷酸/氨基酸序列表与本文同时随同提交并标识如下：一个名为“2021
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04
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15_38883
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601_SQL_ST25.txt”的21,644字节ASCII(文本)文件，创建于2021年4月15日，所述序列表以引用的方式全部并入本文。


[0007]本公开提供了与单分子检测相关的装置、系统和方法。具体而言，本公开提供了用于使用电流波动作为蛋白质结合到核酸靶的读数来序列特异性检测所述核酸靶的装置和方法。如本文所述，本文所述的生物电子装置和方法的某些方面可用于检测和识别任何核酸靶以用于诊断和/或治疗的目的。

技术介绍

[0008]簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关Cas核酸酶是一组参与适应性细菌免疫的可编程核糖核蛋白(RNP)。20个核苷酸(在大多数情况下)的特定DNA和RNA靶基序由以下定义：包含靶序列的CRISPR RNA(crRNA)和恒定序列的反式激活crRNA(tracrRNA)，两者折叠形成结合Cas9(或其他CRISPR相关蛋白，也称为Cas核酸酶)的茎环结构。Cas9 CRISPR复合物与其靶序列的相互作用是通过扫描样品(例如基因组样品)、解开双链DNA并在前间区序列邻近基序的上游结合，直到它找到与dRNP内的单引导RNA分子(sgRNA)互补的靶序列并与该靶序列结合。由sgRNA编程的RNP是一种在以下应用中用于搜索非常特定的靶序列的有效方法，所述应用诸如基因分型(生殖系和体细胞)、HLA分型、用于靶向基因分型的医学遗传学、循环肿瘤DNA、胎儿DNA测试、传染病检测和监测；任何核酸传感、犯罪学和生物防御。
[0009]野生型RNP的功能是切割靶DNA。但是通过使用修饰的RNP(其中核酸酶活性受到抑制)，复合物在靶序列处停止，捕获靶DNA。这些核酸酶缺陷型Cas蛋白表示为dCas，例如dCas9。已经开发了一种将许多RNP结合到石墨烯场效应晶体管通道的装置(例如，捕获靶DNA会导致石墨烯通道表面上的电荷增加，这经由流过石墨烯FET通道的电流的变化来检测)。然而，这种检测是不利的，因为检测是模拟的(记录为电流的连续变化)，并且需要校准来进行靶DNA的量化。因此，目前可用的装置和系统不足以在单分子水平上检测靶DNA。

技术实现思路

[0010]本公开的实施方案包括一种用于检测靶核酸的生物电子装置。根据这些实施方案，所述装置包括第一电极、第二电极和至少一种CRISPR相关蛋白。在一些实施方案中，所述CRISPR相关蛋白被修饰以与所述第一电极和所述第二电极中的至少一个形成化学键。
[0011]在一些实施方案中，所述修饰允许电流通过所述CRISPR相关蛋白，并且所述CRISPR相关蛋白与靶核酸的结合导致电流的偏移。
[0012]在一些实施方案中，所述CRISPR相关蛋白是Cas家族成员蛋白，所述Cas家族成员蛋白选自由Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas10、Cas12、Cas13、Cas14、其核酸酶缺陷型dCas等效物及其任何变体或衍生物组成的组。在一些实施方案中，所述CRISPR相关蛋白是Cas9蛋白或dCas9。
[0013]在一些实施方案中，所述修饰包括添加接头。在一些实施方案中，所述修饰包括在CRISPR相关蛋白的至少两个位点上添加至少两个接头，其中所述至少两个接头连接到第一电极和第二电极中的每一个。在一些实施方案中，所述至少两个接头中的一个接头连接到所述CRISPR相关蛋白上的位点，并且所述至少两个接头中的另一个接头连接到所述CRISPR相关蛋白上的不同位点。
[0014]在一些实施方案中，所述接头经由共价化学键连接到所述CRISPR相关蛋白的非活性区域。在一些实施方案中，所述修饰包括对所述CRISPR相关蛋白进行生物素化。在一些实施方案中，所述接头包含硫代链霉亲和素。在一些实施方案中，所述CRISPR相关蛋白以及所述第一电极和所述第二电极被生物素化，并且所述接头包含具有至少两个生物素结合位点的链霉亲和素分子。
[0015]在一些实施方案中，所述修饰包含HaloTag融合蛋白和氯代烷烃接头。
[0016]在一些实施方案中，所述第一电极和/或所述第二电极包含金、钯、铂、银、铜或其任何合金。
[0017]在一些实施方案中，所述第一电极包括至少部分地覆盖所述第一电极的顶表面的介电层。
[0018]在一些实施方案中，所述介电层的厚度为约1nm至约50nm。
[0019]在一些实施方案中，所述第一电极和所述第二电极定位成使得在两个电极之间形成介于约1nm与约50nm之间的间隙。在一些实施方案中，所述间隙为约2至约8nm。
[0020]本公开的实施方案还包括一种使用本文描述的任何生物电子装置检测靶核酸的方法。根据这些实施方案，所述方法包括将所述生物电子装置和所述靶核酸与引导RNA组合，在所述第一电极与所述第二电极之间施加100mV或更小的电压偏压，以及检测所述CRISPR相关蛋白和所述引导RNA与所述靶核酸结合时电流的偏移。
[0021]在所述方法的一些实施方案中，所述引导RNA与所述靶核酸的一部分互补。
[0022]在所述方法的一些实施方案中，与所述CRISPR相关蛋白未与所述靶核酸结合时相比，电流的偏移包括电流的降低。
[0023]在所述方法的一些实施方案中，所述靶核酸包含在来自受试者的样品中或来源于所述样品。
[0024]在所述方法的一些实施方案中，检测到电流的偏移表明靶核酸存在于样品中。
[0025]在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自由血液样品、血清样品、血浆样品、
唾液样品、尿液样品、粪便样品和粘膜样品组成的组。
[0026]在所述方法的一些实施方案中，所述靶核酸是DNA或RNA。
[0027]在所述方法的一些实施方案中，所述靶核酸来源于病原生物或与病原生物相关。在所述方法的一些实施方案中，所述靶核酸来源于疾病或病状、与疾病或病状相关或指示疾病或病状。在所述方法的一些实施方案中，所述靶核酸来源于工程生物或与工程生物相关。在所述方法的一些实施方案中，所述靶核酸来源于SARS
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CoV
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2感染或与SARS
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CoV
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2感染相关。
[0028]本公开的实施方案还包括一种系统，所述系统包括多个本文所述的生物电子装置。在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测靶核酸的生物电子装置，其包括：第一电极；第二电极；和至少一种CRISPR相关蛋白，所述CRISPR相关蛋白被修饰以与所述第一电极和所述第二电极中的至少一个形成化学键。2.如权利要求1所述的装置，其中所述修饰允许电流通过所述CRISPR相关蛋白，并且其中所述CRISPR相关蛋白与靶核酸的结合导致所述电流的偏移。3.如权利要求1或权利要求2所述的装置，其中所述CRISPR相关蛋白是Cas家族成员蛋白，所述Cas家族成员蛋白选自由Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas10、Cas12、Cas13、Cas14、其核酸酶缺陷型dCas等效物及其任何变体或衍生物组成的组。4.如权利要求1至3中任一项所述的装置，其中所述CRISPR相关蛋白是Cas9蛋白或dCas9。5.如权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述修饰包括添加接头。6.如权利要求1至5中任一项所述的装置，其中所述修饰包括在所述CRISPR相关蛋白上的至少两个位点上添加至少两个接头，并且其中所述至少两个接头中的一个连接到所述第一电极和所述第二电极中的每一个。7.如权利要求5或权利要求6所述的装置，其中所述接头经由共价化学键连接到所述CRISPR相关蛋白的非活性区域。8.如权利要求1至7中任一项所述的装置，其中所述修饰包括对所述CRISPR相关蛋白进行生物素化。9.如权利要求5至8中任一项所述的装置，其中所述接头包含硫代链霉亲和素。10.如权利要求5至9中任一项所述的装置，其中所述CRISPR相关蛋白以及所述第一电极和所述第二电极被生物素化，并且其中所述接头包含具有至少两个生物素结合位点的链霉亲和素分子。11.如权利要求5至7中任一项所述的装置，其中所述修饰包含HaloTag融合蛋白和氯代烷烃接头。12.如权利要求1至11中任一项所述的装置，其中所述第一电极和/或所述第二电极包含金、钯、铂、银、铜或其任何合金。13.如权利要求1至12中任一项所述的装置，其中所述第一电极包括至少部分地覆盖所述第一电极的顶表面的介电层。14.如权利要求13所述的装置，其中所述介电层的厚度为约1nm至约50n...

【专利技术属性】
技术研发人员：S林德赛，K安德森，M克纳彭伯格，S阿夫萨里马马加尼，JL斯韦特，
申请(专利权)人：代表亚利桑那大学的亚利桑那校董事会，
类型：发明
国别省市：