检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器、制备方法及应用，所述荧光生物传感器包括：识别探针、报告探针、信号放大元件、检测装置；所述识别探针由链霉亲和素磁珠和生物素化核酸适配体组成；所述识别探针和报告探针通过DNA双链的碱基互补配对作用进行连接；识别探针作为敏感元件直接感受被检测的AFB1，信号放大元件作用于未进行DNA双链连接的识别探针，释放与识别探针结合的AFB1，产生荧光强度信号，通过所述检测装置，光信号转换为电信号。本发明专利技术可以实现AFB1的特异性高灵敏的浓度检测，且成本低，方便快捷。方便快捷。方便快捷。

【技术实现步骤摘要】
检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物传感检测
，尤其涉及一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器的制备方法，并将其应用于黄曲霉毒素B1的检测应用。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉菌产生的次级代谢产物，具有较强的毒性、诱变性及致癌性，其理化性质稳定，很难被降解。根据国际癌症研究机构(IARC)分类，该毒素被归类为I类致癌物。欧盟(EC,No.1126/2007)和中国(GB2761
‑
2017)分别将AFB1在谷物中的最大残留水平(MRLs)设定为2μg/kg和5μg/kg。传统的检测方法，例如：高性能液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)，可以进行AFB1检测，并且已经具有较高的灵敏度和成熟的技术。然而，这些方法依赖于昂贵的仪器设备和专业的技术实验室研究人员进行检测，同时提纯步骤繁琐，检测耗时较长。这些缺点在一定程度上限制了利用传统方法进行霉菌毒素检测的发展。
[0003]作为一种新兴的测定技术，生物传感器用于霉菌毒素的检测具有显著的优势。适配体是一段经筛选的寡核苷酸序列，能够与相应的靶标进行高亲和力和强特异性的结合。相比于抗体这一生物识别元件，适配体具有批间差异小、成本低、修饰简单和容易保存等特点。核酸外切酶I能够特异性地从3
’→5’
方向降解单链DNA，而不会作用于双链DNA或者3
’
末端磷酸化的单链DNA。
[0004]目前已有很多利用适配体双链竞争并结合酶切信号放大的方法应用于真菌毒素检测的报道。例如，Xuhan Xia等人利用双端互补的适配体探针，结合聚集诱导发光染料和酶切放大策略，报告了无标记的AFB1检测方法。Linyue Tang等人利用两段与适配体双端分别互补的序列，与适配体共同合成水凝胶，并通过酶切循环扩增，报告了使用电子天平读数的AFB1检测方法。尽管这些方法运用了酶切放大策略，但其检测灵敏度受限于互补序列的选择。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器、制备方法及应用，本专利技术可以实现AFB1的特异性高灵敏的浓度检测，且成本低，方便快捷，详见下文描述：
[0006]本专利技术的荧光生物传感器以磁珠为载体，以AFB1的核酸适配体为识别元件，两者结合构成识别探针，以核酸适配体的部分互补序列标记荧光作为报告探针。其中，AFB1的核酸适配体序列为：5
’‑
GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA
‑3’
，核酸适配体的部分互补序列为：5
’‑
TTT AAG GGC ACG AGA CA
‑3’
。AFB1的核酸适配体序列已公开(J.A.Cruz
‑
aguado,(12)Patent Application Publication(10)Pub.No.:US 2012/0225494 A1,1(2012).)。
[0007]优选的，磁珠表面修饰了链霉亲和素。
[0008]优选的，核酸适配体的5
’
末端增加了6个胸腺嘧啶(T)，以减少其与磁珠连接时的
空间位阻。
[0009]优选的，核酸适配体的5
’
末端修饰了生物素。
[0010]优选的，部分互补序列的5
’
末端标记了荧光。
[0011]本专利技术还提供了上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0012]S1，在反应缓冲液中加入所述磁珠和所述核酸适配体，将所述核酸适配体偶联到所述磁珠的结合位点上；
[0013]S2，将S1步骤得到的磁珠和所述核酸适配体的部分互补序列在杂交缓冲液中反应15～60min，通过碱基互补配对，组成由磁珠、核酸适配体和荧光标记互补序列组成的生物传感器件。
[0014]优选的，步骤S1之前将所述核酸适配体在95℃变性5min中，随后立即置于
‑
20℃冷却降温并保存直至使用。
[0015]该优选方案中，高温变形后立即冷却降温可以消除所述核酸适配体的二级结构，使其维持单链状态，有利于后续的杂交反应。
[0016]优选的，步骤S1中将所述核酸适配体偶联到所述磁珠的结合位点之后，还包括磁分离去除过量的核酸适配体单链，再将封闭剂连接到所述磁珠上进行封闭。
[0017]优选的，步骤S2中将磁珠与部分互补序列杂交之后，还包括磁分离去除过量的部分互补序列单链。
[0018]该优选方案中，使用封闭剂对磁珠上未结合的空余位点进行封闭处理，从而有利于减少检测过程中对荧光标记的部分互补序列的非特异性吸附，降低背景噪声，提高检测灵敏度。
[0019]进一步的，所述封闭剂为牛血清蛋白(BSA)或者脱脂奶粉。
[0020]进一步的，步骤S1中，所述反应缓冲液为Tris的盐缓冲液。
[0021]具体地，Tris盐缓冲液可包括10mM Tris
‑
HCl(pH 7.5),1mM EDTA,1M NaCl,0.01％～0.1％Tween
‑
20。
[0022]进一步的，步骤S2中，所述杂交缓冲液为Tris的盐缓冲液。具体地，Tris盐缓冲液可包括10mM Tris
‑
HCl(pH 7.5),120mM NaCl,0.01％～0.1％Tween
‑
20。
[0023]本专利技术还提供了上述荧光生物传感器用于定量检测AFB1的方法，包括以下步骤：
[0024]A1，将10μL上述荧光生物传感器与100μL 0ng/mL～1000ng/mL的AFB1标准溶液在加入核酸外切酶I的结合缓冲液中混合孵育1h，经过磁分离后将沉淀重悬于检测缓冲液中，检测所述重悬液在520nm处的荧光强度；所述激发波长设置为480nm。
[0025]A2，将步骤A1中加样0ng/mLAFB1标准溶液检测到的荧光强度作为空白值F0，将步骤S1中加样0ng/mLAFB1标准溶液检测到的荧光强度作为信号值F，得出荧光强度下降值(F0
‑
F)与AFB1浓度的标准曲线。
[0026]A3，将10μL上述荧光生物传感器与100μL 待测浓度的AFB1溶液在加入核酸外切酶I的结合缓冲液中混合孵育1h，经过磁分离后将沉淀重悬于检测缓冲液中，检测所述重悬液在520nm处的荧光强度，代入步骤S2中的标准曲线，得出待测溶液中AFB1的浓度。
[0027]优选的，步骤A1和A3中，结合缓冲液为Tris的盐缓冲液。具体地，Tris盐缓冲液可包括10mM Tris
‑
HCl(pH 8.0),120mM NaCl,5mM MgCl2,5mM KCl,0.01％～0.1％Tween
‑
20。
[0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器包括：识别探针、报告探针、信号放大元件、检测装置；所述识别探针由链霉亲和素磁珠和生物素化核酸适配体组成；所述识别探针和报告探针通过DNA双链的碱基互补配对作用进行连接；识别探针作为敏感元件直接感受被检测的AFB1，信号放大元件作用于未进行DNA双链连接的识别探针，释放与识别探针结合的AFB1，产生荧光强度信号，通过所述检测装置，光信号转换为电信号。2.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器，其特征在于，所述报告探针为标记荧光的部分互补序列，其核苷酸序列为5
’‑
TTT AAG GGC ACG AGA CA
‑3’
；所述信号放大元件为核酸外切酶I。3.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器，其特征在于，所述检测装置为荧光酶标仪，采用480nm的激发波长和520nm的发射波长。4.一种用于权利要求1
‑
3中任一权利要求所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：占鸿燕，李晨曦，杨斯，夏华，刘蓉，陈文亮，徐可欣，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：