一种用于检测microRNA的阴极光电传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开一种基于p

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测microRNA的阴极光电传感器的制备方法


[0001]本专利技术属于光电化学及生物分析领域，具体涉及一种用于检测microRNA的基于p
‑
n异 质结猝灭模式和CRISPR/Cas12a反切活性的阴极光电化学生物传感器。

技术介绍

[0002]microRNA(miRNA)是细胞内一种短单链内源核苷酸，在许多肿瘤细胞内特异性表达， 是一类热门的肿瘤标志物。本专利技术中所检测的miRNA为miRNA
‑
122，在肝细胞中含量丰富， 通常占到肝细胞总miRNA含量的70％，在肝癌细胞中表达为数量显著下调或者缺失，可作 为检测肝细胞癌的特异性生物标志物。因此，对miRNA
‑
122进行检测有利于对早期肝细胞癌 的诊断，及时掌握疾病的进展以及帮助治疗。
[0003]CRISPR体系是一种在生物传感领域被广泛应用的生物技术工具。本专利技术中所使用的 CRISPR/Cas12a是一种2类V
‑
A CRISPR相关酶，可以通过与单链引导RNA(crRNA)相结 合从而靶向检测DNA/RNA，同时通过编辑不同的特异性crRNA可以达到特异性检测靶标 DNA/RNA的目的。这一特性使其在识别目标时具有良好的特异性，同时也使其在面对不同 的生物分析物时具有更大的选择灵活性。此外，CRISPR/Cas12a
‑
crRNA复合物与引导互补的 单链DNA(ssDNA)结合后，还能表现出强的、非特异性的ssDNA反切割活性。在本专利技术中将 CRISPR/Cas12a应用于光电生物传感器中，在被特异性单链DNA激活后切割电极上的单链 DNA产生信号变化。
[0004]光电化学传感是一种新兴的检测技术，同时具备化学发光和电化学的优点，并具有灵敏 度高，设备简单，成本低廉，易于微型化和集成化等优势。目前，miRNA
‑
122常见的检测方 法有荧光分析检测、电化学分析检测、电化学发光分析检测和光电分析检测，相比之下光电 化学生物传感器技术的高灵敏度和低成本在检测miRNA方面更加具有优势。阴极光电化学 传感器技术是将功能性p型半导体与光电生物传感器技术两者的优势相结合而形成的新型检 测方法。在光电化学生物传感器的应用中p型半导体材料在电解液中更倾向于与电子受体相 互作用而非电子供体。与传统的光电化学传感技术相比，阴极光电化学生物传感器技术具有 有效抵抗还原性物质干扰的特点因而与阳极光电生物化学传感器相比较稳定性更好。目前研 究广泛的p型NiO材料具有稳定性高，成本低以及生物相容性好等优点但是自身的光电转换 效率低限制了它在实际光电检测中的应用。因此如何改善NiO光电转换效率低下的问题亟需 解决。考虑到NiO的纳米结构具有较高的表面积因此在表面上负载敏化剂进而敏化NiO来提 高其光电转换效率是一种可行的方法。分子染料是一种常见的敏化剂，具有组装过程可控， 稳定性高，复现性强等优点，同时与电解液间具有良好的电子通信性能可以控制分子染料在 NiO表面的取向和排列。本专利技术引入了一种铱配合物作为敏化剂敏化NiO来提高NiO的光电 转换效率。

技术实现思路
：
[0005]鉴于现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种基于p
‑
n异质结猝灭模式和CRISPR/
Cas12a 反切活性的阴极光电化学生物传感器用于检测microRNA的制备方法。
[0006]包括以下步骤：
[0007]1、染料[(C6)2Ir(dcbpy)]+
PF6‑
敏化NiO电极的制备
[0008]所述染料[(C6)2Ir(dcbpy)]+
PF6‑
(其中C6为香豆素
‑
6，dcbpy为2,2'
‑
联吡啶
‑
4,4'
‑
二羧酸) 的结构式为
[0009][0010]将依次经过丙酮，乙醇，水清洗的ITO电极片在真空条件下干燥后，将电极片放入含有 六水合硝酸镍和六亚甲基四胺的离心管中，离心管置于烘箱中90℃加热1小时，在空气中冷 却至室温后，再置于马弗炉300℃下焙烧30分钟，得到镀有氧化镍薄膜的电极。然后将电极 浸泡到[(C6)2Ir(dcbpy)]+
PF6‑
的DMF(50μM，400μL)溶液中12个小时，使[(C6)2Ir(dcbpy)]+ PF6‑
组装到纳米NiO薄膜上，然后用DMF和CH3CN依次冲洗两次，以去除物理吸附的 [(C6)2Ir(dcbpy)]+
PF6‑
，然后在N2气流中干燥后获得[(C6)2Ir(dcbpy)]+
PF6‑
/NiO/ITO电极。
[0011]2、DNA1‑
Bi2S3量子点修饰的光电传感器制备
[0012]首先，将Bi2S
3 QDs进行活化，随后与DNA1混合，放置在摇床中搅拌过夜。然后加入 BSA以去除非特异性位点。将所得溶液进行离心处理，使DNA1‑
Bi2S3分散在PBS溶液(0.1M, pH＝7.4)中。在[(C6)2Ir(dcbpy)]+
PF6‑
/NiO/ITO电极上加入含有乙酸的壳聚糖溶液，于50℃ 下干燥40分钟，然后用NaOH溶液和超纯水洗2次。接着将戊二醛溶液滴加到步骤1所制备 的电极上室温反应30分钟后加入DNA2并在37℃下孵育1小时，将制备的DNA1‑
Bi2S
3 QDs 混合液滴加在修饰过的电极上，最后，用PBS溶液冲洗后，成功组装电极。
[0013]所述Bi2S3量子点的制备方法：首先，取0.5g牛血清蛋白(BSA)于100mL烧瓶中， 并用16mL去离子水溶解，持续搅拌等到牛血清蛋白完全溶解，加大搅拌力度，缓慢向BSA 溶液中加入2mL的50mM五水硝酸铋溶液使混合溶液pH＜5。在这种pH环境下Bi
3+
可 以和BSA配位，从而阻止离子水解。继续搅拌半个小时后，加入6M氢氧化钠溶液(2.4g,10 mL)使半胱氨酸的硫醇基团去质子化，并调节pH至12，以稳定Bi2S3量子点的生成。接着 再在室温下剧烈搅拌混合溶液6～8小时，得到黑色溶液。最后还需要置于去离子水中透析24 个小时进行纯化以除去多余前驱体。
[0014]所述DNA1的序列为：5
’‑
TTTTTTACAAGGGCTAGG
‑3’
(5
’
端修饰
‑
NH2)
[0015]所述DNA2的序列为：5
’‑
CCTAGCCCTTGT
‑3’
(5
’
端修饰
‑
NH2)
[0016]3、靶标miRNA的检测
[0017]首先，10μL(1μM)目标microRNA和10μL H1(2μM)置于摇床中37℃旋转两小时, 其次是添加10μL CRISPR/Cas12a酶(50nM)和10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于p
‑
n异质结猝灭模式和CRISPR/Cas12a反切活性的阴极光电化学生物传感器检测microRNA的测定方法，其特征在于包括以下步骤：（1）染料[(C6)2Ir(dcbpy)]
+
PF6−
敏化NiO电极的制备所述染料[(C6)2Ir(dcbpy)]
+
PF6−
（其中C6为香豆素
‑
6，dcbpy为2,2
’‑
联吡啶
‑
4,4
’‑
二羧酸）的结构式为：将面积固定的的ITO电极在真空条件下干燥后放入含有六水合硝酸镍和六亚甲基四胺的离心管中，离心管置于烘箱中90 ℃加热1小时，在空气中冷却至室温后，再置于马弗炉300 ℃下焙烧30分钟，得到镀有氧化镍薄膜的电极。然后将电极浸泡到[(C6)2Ir(dcbpy)]
+
PF6−
的DMF（50
ꢀµ
M，400 μL）溶液中12个小时，使[(C6)2Ir(dcbpy)]
+
PF6−
组装到纳米NiO薄膜上，然后用DMF和CH3CN依次冲洗两次。随后在N2气流中干燥后获得[(C6)2Ir(dcbpy)]
+
/NiO/ITO光电极；（2）DNA1‑
Bi2S3量子点修饰的光电传感器制备将Bi2S3量子点进行活化后与DNA1混合，放置在摇床中搅拌过夜。然后加入BSA以去除非特异性位点随后将所得溶液进行离心处理。在步骤（2）中制备的[(C6)2Ir(dcbpy)]
+
/NiO/ITO电极上加入含有乙酸的壳聚糖溶液，于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春香，宗成雪，吕蒙伟，陈晓东，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：