一种检测OTA的核酸探针、血糖仪生物传感器、制备方法、检测方法和用途技术

本发明专利技术属于分析化学领域，具体是涉及到一种检测OTA的核酸探针、血糖仪生物传感器、制备方法、检测方法和用途，血糖仪生物传感器包括：检测OTA的核酸探针，通过生物素固定在磁珠表面；核酶链，序列为SEQ ID NO：2；底物链，序列为SEQ ID NO：3，其5

【技术实现步骤摘要】
一种检测OTA的核酸探针、血糖仪生物传感器、制备方法、检测方法和用途


[0001]本专利技术属于分析化学领域，具体是涉及到一种检测OTA的核酸探针、血糖仪生物传感器、制备方法、检测方法和用途。

技术介绍

[0002]真菌毒素污染是一个世界性的公共安全问题，世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织 (FAO)把真菌毒素列为食源性疾病的三大根源之首。迄今为止全球已经确认了大约400种真菌毒素及其类似物，其中赭曲霉毒素由于其对动物和人类有严重的毒性作用而备受关注。赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)等丝状菌属产生的一种次级代谢产物，广泛存在于小麦、玉米、干果、咖啡、葡萄酒和啤酒等食品和饮料中。赭曲霉毒素主要包括7种结构相似的化合物，如赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)等。其中，OTA分布广、半衰期较长、化学稳定性和热稳定性高，而且具有强烈的肾毒性、肝毒性、神经毒性、免疫毒性、致癌性、致畸性和致突变性，能够通过食物链在人体富集，严重危害人们的身体健康。因此，发展可以高灵敏检测OTA等食品中有毒有害小分子的分析方法具有重要意义。
[0003]目前检测食品中OTA的传统方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、色谱
‑
质谱联用法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。近年来，以核酸适体作为特异性识别分子的各种检测OTA的生物传感器得到的迅速发展。核酸适体是通过体外富集系统进化技术获得的一类单链核酸分子，制备简单，性质稳定，能够特异性结合各种目标分子如蛋白质、金属离子、小分子甚至细胞。尤其对于检测不易获得抗体的小分子、金属离子等具有独到优势。文献中也报道了一些基于核酸适体的OTA检测技术，如电化学法、化学发光法、比色法、荧光法和表面增强拉曼光谱法等。
[0004]血糖仪由于其手持式尺寸、可靠的定量、容易的操作和低廉的花费，已成为世界上应用最广泛的即时检验装置。传统的血糖仪只能用于测定血糖含量，近年来发展的利用蔗糖转化酶作为标记物将蔗糖水解转化成葡萄糖，拓宽了血糖仪的应用，为实现不同的非葡萄糖目标物的检测提供了理论基础。
[0005]OTA的检测技术中，传统的薄层色谱法操作简单，试剂便宜，但是检测灵敏度和重现性均较差，而且检测时间长，不易实现自动化，无法满足现代化检测中的快速、灵敏、可靠、方便等需求。高效液相色谱法灵敏度和准确度均较高，是实验室中最常用的标准检测方法，但是该方法需要依赖大型精密仪器，而且需要专业的实验技术人员操作，不适合应用于现场快速检测。基于免疫学原理的酶联免疫吸附法快速、灵敏、经济、准确，但存在抗体制备困难、底物干扰以及假阳性结果多的缺点。胶体金免疫层析法非常适合用于现场快速检测，但同样依赖于抗体，且存在只能定性不能准确定量的缺点。基于核酸适体的生物传感器仍然依赖于各种大型检测仪器，不适用于现场检测。而基于血糖仪的即时检验方法由于血糖仪自身的限制，其检测灵敏度还有所欠缺。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测OTA的核酸探针、血糖仪生物传感器、制备方法、检测方法和用途，其检测线性范围宽，可以实现即时检测，检测下限低，灵敏度高。
[0007]本专利技术的内容包括一种检测OTA的核酸探针，所述核酸探针(aptamer probe，简写为 AP，即适体探针)的序列为SEQ ID NO：1，5
’
端修饰有生物素，SEQ ID NO：1的序列为：NO：1的序列为：
[0008]其中，下划线部分为待测目标分子OTA的适体序列，可以与目标分子OTA特异性识别并紧密结合。
[0009]其中，斜体标记序列与核酶链杂交，使核酶链在没有目标物OTA时呈活性封闭状态。
[0010]其中，加粗部分为间隔，使适体探针识别OTA目标分子的适体序列部分远离磁珠表面，减小OTA与适体探针特异性结合的空间位阻。
[0011]该适体探针的5
’
端修饰有生物素，通过与磁珠上的亲和素特异性结合将适体探针固定到磁珠表面。
[0012]本专利技术提供一种检测OTA的血糖仪生物传感器，包括：
[0013]检测OTA的核酸探针，通过生物素固定在磁珠表面；
[0014]核酶链(DNAzyme strand，简写为DS)，序列为SEQ ID NO：2；
[0015]底物链(substrate strand，以下为SS)，序列为SEQ ID NO：3，其5
’
端修饰有生物素，通过生物素固定在磁珠表面，3
’
端修饰有巯基，通过巯基连接有蔗糖转化酶。
[0016]SEQ ID NO：2的序列为：
[0017][0018]其中，5
’
端斜体部分与适体探针的斜体部分5
’‑ꢀ
互补，在没有目标物OTA时核酶链与适体探针稳定杂交。
[0019]其中，3
’
端斜体部分与底物链5
’
端斜体部分互补。
[0020]其中，加粗部分为8
‑
17核酶链的催化核心。
[0021]其中，该核酶链5
’
端斜体标记的下划线部分序列和3
’
端斜体标记序列称之为核酶链的两个手臂，可以与底物链的3
’
端和5
’
端分别互补杂交。
[0022]SEQ ID NO：3的序列为，NO：3的序列为，
[0023]其中，5
’
端斜体部分和3
’
端斜体部分称之为底物链的两个手臂，分别与核酶链的3
’
端手臂和5
’
端手臂互补杂交。
[0024]其中，rA为核糖核苷，在底物链与酶链杂交以及Zn
2+
等辅助因子的作用下发生水解，使底物链断裂。
[0025]其中，5
’
端修饰有生物素，通过与磁珠表面亲和素的特异性结合将底物链固定到磁珠表面。
[0026]其中，3
’
端修饰有巯基，通过巯基将蔗糖转化酶连接到底物链3
’
端。
[0027]其中，5
’
端加粗部分为间隔，使底物链远离磁珠表面，减小核酶链与底物链杂交的空间位阻。
[0028]其中，3
’
端加粗部分为间隔，使3
’
端修饰的大分子蛋白质蔗糖转化酶远离磁珠表面，进一步减小核酶链与底物链杂交时的空间位阻。
[0029]所述血糖仪生物传感器，在加入OTA目标分子之前，核酶链与适体探针稳定杂交，底物链完整地保留在磁珠表面，进行磁性分离后清液中几乎不含有蔗糖转化酶，蔗糖转化的葡萄糖极少，用血糖仪检测时只能检测到很低的背景信号。
[0030]所述生物传感器，加入一定浓度的OTA目标分子与磁珠上的适体探针反应，适体探针由于与其目标分子特异性结合而发生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测OTA的核酸探针，其特征是，核酸探针的序列为SEQ ID NO：1，其5
’
端修饰有生物素。2.一种检测OTA的血糖仪生物传感器，其特征是，包括：如权利要求1所述的检测OTA的核酸探针，通过生物素固定在磁珠表面；核酶链，序列为SEQ ID NO：2；底物链，序列为SEQ ID NO：3，其5
’
端修饰有生物素，通过生物素固定在磁珠表面，3
’
端修饰有巯基，通过巯基连接有蔗糖转化酶。3.一种如权利要求2所述的检测OTA的血糖仪生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下步骤，1)将底物链通过化学修饰连接上蔗糖转化酶；2)将核酸探针与核酶链退火杂交，形成核酸探针
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核酶链复合物；3)将核酸探针
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核酶链复合物与底物链混合，核酸探针
‑
核酶链复合物与底物链分别固定在磁珠表面，形成检测OTA的血糖仪生物传感器。4.如权利要求3所述的检测OTA的血糖仪生物传感器的制备方法，其特征是，步骤1)的操作步骤为，将底物链、缓冲液和三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐溶液混合，孵育，离心，清洗；将sulfo
‑
SMCC溶液和蔗糖转化酶混合，孵育，离心，清洗；将清洗完后的底物链和蔗糖转化酶混合，孵育，离心，清洗，最后分散，底物链通过化学修饰连接上蔗糖转化酶。5.如权利要求4所述的检测OTA的血糖仪生物传感器的制备方法，其特征是，底物链、缓冲液和三(2<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张松柏，李爽，周之韵，晏日鑫，肖纪苗，周航，胡霞，杨基峰，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：