一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用，所述荧光生物传感系统包括哑铃型DNA探针(DSP)、CRISPR/Cas 12a蛋白、crRNA与荧光报告探针；所述哑铃DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点，在Dam酶存在时被甲基化并切割形成含3

【技术实现步骤摘要】
一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及无模板扩增策略及荧光生物传感器
，特别是涉及一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是表观遗传学的一种，在调节基因表达，细胞分化和维持基因组稳定性方面发挥重要作用，能在不改变DNA序列的前提下，将甲基从甲基供体——甲硫腺苷氨酸转移到相应的胞嘧啶或者腺嘌呤上，而甲基化转移酶在此过程中发挥重要作用。近年来，多项研究指出，通过沉默相关转录基因，异常的甲基化转移酶活性能够导致相关疾病的产生，如肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病等。而甲基化转移酶水平升高对于疾病的发生发展乃至是预后方面有一定的指示作用，因此将其作为相关疾病的分子标记物具有不可忽略的诊断与药用价值。
[0003]传统的甲基化转移酶检测方法如放射性元素标记法、高效液相色谱法、甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)法等被开发出来，但复杂的操作、昂贵仪器设备和不够理想的灵敏度限制了它们的应用，因此等温扩增法因其操作简单、结果快速、灵敏度和成本低、能在体内进行等优点，使其在一众传统方法中脱颖而出。研究者们常常将DNA作为载体运用在等温扩增方法中，如滚环扩增RCA、SDA 链置换反应、等温指数扩增EXPAR和杂交链式反应HCR等。而上述方法虽然提高了检测性能，但仍存在耗时较长，背景较高，检测限不够理想等问题。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统及其构建与应用，用于解决现有技术中Dam甲基化转移酶的检测方法灵敏度和时效性不够理想等问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统，包括哑铃型DNA探针(DSP)、CRISPR/Cas 12a 蛋白、crRNA与荧光报告探针；所述哑铃DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点，所述Dam甲基转移酶识别位点的序列为5
’
GATC3
’
，两两形成回文序列；存在Dam甲基转移酶时，所述哑铃DNA探针被甲基化并切割形成含3
’
端羟基的DNA链，所述DNA链的3
’
端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链；所述CRISPR/Cas 12a蛋白与富含A 碱基的crRNA特异性识别所述DNA长单链并与其互补，引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性，将两端分别标记有荧光基团与荧光淬灭基团的荧光报告探针剪切从而产生荧光信号；不同浓度的Dam甲基转移酶催化反应可产生不同强度的荧光信号。
[0006]进一步，所述哑铃型DNA探针的序列如SEQIDNO.1所示。
[0007]进一步，所述crRNA的序列如SEQIDNO.2所示。
[0008]进一步，所述荧光报告探针的序列如SEQIDNO.3所示。
[0009]进一步，所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种；优选地，所述荧光基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0010]进一步，所述哑铃DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA 双链，即四条含3
’
端羟基的DNA链。
[0011]进一步，切割哑铃DNA探针使用的剪切酶为Dpn I甲基化限制性内切酶。
[0012]进一步，切割哑铃DNA探针时还需要加入S腺苷甲硫氨酸。
[0013]进一步，所述无模板延伸反应需加入原料脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTTPs)和 TdT末端转移酶的激活剂，所述激活剂为钴离子；优选地，所述激活剂为二氯化钴。
[0014]本专利技术第二方面提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统的构建方法，包括如下步骤：
[0015](1)制备哑铃型DNA探针(DSP)：采用如SEQ ID NO.1所示序列的哑铃单链，所述哑铃单链5
’
端修饰有磷酸基团P、3
’
端连接有OH，在DNA连接酶的作用下，5
’
端磷酸基团P与3
’
端OH连接形成封闭的哑铃环，连接端口处为5
’‑
GAAG
‑3’
，得到含哑铃型DNA探针的体系；(2)甲基化与酶切反应：在含哑铃型DNA探针的体系中加入Dam甲基化转移酶、Dpn I甲基化限制性内切酶与 S腺苷甲硫氨酸，进行甲基化与酶切反应，哑铃DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链，即四条含3
’
端羟基的DNA链；
[0016](3)无模板扩增反应：取甲基化与酶切反应的产物，加入TdT末端转移酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTTPs)和TdT末端转移酶激活剂，经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链；
[0017](4)在无模板扩增反应产物中加入CRISPR/Cas12a蛋白、如SEQ ID NO.2 所示序列的crRNA与如SEQIDNO.3所示序列的荧光报告探针，构建得到所述检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统。
[0018]进一步，所述步骤(1)中，哑铃型DNA探针(DSP)的制备方法包括如下步骤：取哑铃DNA单链干粉，用TE缓冲液溶解，再加入DNA连接酶反应缓冲液，进行反应，再加入DNA连接酶，反应形成哑铃环。
[0019]可选地，所述步骤(1)中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶，所述DNA 连接酶反应缓冲液为10
×
T4 DNA连接酶反应缓冲液。可选地，所述步骤(1) 中，加入DNA连接酶反应缓冲液后，先于95℃加热5分钟，再缓慢降至室温，加入DNA连接酶。
[0020]可选地，所述步骤(1)中，加入DNA连接酶后，先于16℃反应3小时，再于70℃反应10分钟，使哑铃成环。
[0021]可选地，所述步骤(1)中，当哑铃环形成后，加入核酸外切酶以去除未成环的单双链，并灭活核酸外切酶，得到只含哑铃型DNA探针的体系。
[0022]可选地，所述步骤(1)中，所述核酸外切酶选用核酸外切酶I和核酸外切酶III。
[0023]可选地，所述步骤(1)中，当哑铃环形成后，加入核酸外切酶于37℃反应 1小时，再于90℃反应20分钟使核酸外切酶完全灭活，以保证体系中只存在哑铃环，避免存在未成环的单双链。
[0024]进一步，所述步骤(2)中，甲基化与酶切反应在1
×
Dam甲基转移酶缓冲液和1
×
rCutsmart缓冲液中进行。
[0025]进一步，所述步骤(2)中，甲基化与酶切反应时间为30
‑
75分钟，优选为 45
‑
60分钟，更优选为45分钟。
[0026]进一步，所述步骤(2)中，甲基化与酶切反应温度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统，其特征在于，包括哑铃型DNA探针、CRISPR/Cas 12a蛋白、crRNA与荧光报告探针；所述哑铃DNA探针内含四个Dam甲基转移酶识别位点，所述Dam甲基转移酶识别位点的序列为5
’
GATC 3
’
，两两形成回文序列；存在Dam甲基转移酶时，所述哑铃DNA探针被甲基化并切割形成含3
’
端羟基的DNA链，所述DNA链的3
’
端羟基被TdT末端转移酶识别并经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链；所述CRISPR/Cas 12a蛋白与富含A碱基的crRNA特异性识别所述DNA长单链并与其互补，引发Cas12a顺式切割活性并激发反式切割活性，将两端分别标记有荧光基团与荧光淬灭基团的荧光报告探针剪切从而产生荧光信号；不同浓度的Dam甲基转移酶催化反应可产生不同强度的荧光信号。2.根据权利要求1所述的荧光生物传感系统，其特征在于：所述哑铃型DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光报告探针的序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述荧光基团选自HEX、FAM、Cy3、Cy5中的至少一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种；和/或，所述哑铃DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链，即四条含3
’
端羟基的DNA链；和/或，切割哑铃DNA探针使用的剪切酶为Dpn I甲基化限制性内切酶；和/或，切割哑铃DNA探针时还需要加入S腺苷甲硫氨酸；和/或，所述无模板延伸反应需加入原料脱氧胸腺嘧啶核苷酸和TdT末端转移酶的激活剂，所述激活剂为钴离子。3.一种检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备哑铃型DNA探针：采用如SEQ ID NO.1所示序列的哑铃单链，所述哑铃单链5
’
端修饰有磷酸基团P、3
’
端连接有OH，在DNA连接酶的作用下，5
’
端磷酸基团P与3
’
端OH连接形成封闭的哑铃环，连接端口处为5
’‑
GAAG
‑3’
，得到含哑铃型DNA探针的体系；(2)甲基化与酶切反应：在含哑铃型DNA探针的体系中加入Dam甲基化转移酶、Dpn I甲基化限制性内切酶与S腺苷甲硫氨酸，进行甲基化与酶切反应，哑铃DNA探针被甲基化并切割形成两条发夹结构和一条DNA双链，即四条含3
’
端羟基的DNA链；(3)无模板扩增反应：取甲基化与酶切反应的产物，加入TdT末端转移酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸和TdT末端转移酶激活剂，经无模板扩增反应延伸出富含T碱基的DNA长单链；(4)在无模板扩增反应产物中加入CRISPR/Cas12a蛋白、如SEQ ID NO.2所示序列的crRNA与如SEQ ID NO.3所示序列的荧光报告探针，构建得到所述检测Dam甲基转移酶的荧光生物传感系统。4.根据权利要求3所述的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：易钢，赵书慧，张文秀，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：