一种CRISPR-SPR生物传感器芯片及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学和光电子学技术领域，具体涉及一种CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR
‑
SPR生物传感器芯片及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和光电子学
，具体涉及一种CRISPR
‑
SPR生物传感器芯片及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]近年来，全基因组测序已可对各种病理学的生物标志物进行广泛的分析和鉴定，促使开发了各种靶标特异性核酸检测工具。在过去的30年中，基于聚合酶链式反应的核酸诊断测试方法已经得到极大的优化，甚至可以用于扩增和检测目标基因组序列。尽管核酸检测技术取得了显著的进步，但是大多数核酸检测方法因为需要多步反应，多种试剂以及训练有素的操作人员和复杂的仪器，在应用时仍然耗时且昂贵。另外，为提高对目标核酸分子检测的靶向性，需要开发更加精确的定量分析工具以及更加复杂的引物探针并结合更加先进的光学组件进行检测。因此，新的核酸分子检测方法需要克服常规核酸检测策略的局限性，以提供低成本、高集成度、紧凑便捷的核酸诊断工具，从而扩展其临床应用。
[0003]在最近的研究中，基于成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)及相关的核酸酶(Cas)的技术已经与光学检测方法结合用于常规的核酸检测。其中，CRISPR
‑
Cas蛋白在单链引导RNA(sgRNA)分子的引导下，可以成为靶向特异性序列的强大工具。例如，“SHERLOCK”方法先通过RPA或RT
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RPA技术对待测序列进行扩增，然后利用引导RNA与CRISPR相关核酸酶13(Cas13a)的复合物与待测物进行反应，若待测物中含有与目标序列一致的核酸片段，则依核酸片段浓度的不同产生荧光信号。又如“HOLMES”方法，因为使用可直接靶向DNA分子的Cas12a而无需经过“SHERLOCK”方法中DNA向RNA的转录过程。无论是“SHERLOCK”还是“HOLMES”方法，二者都可以通过单链核酸探针来对DNA分子或RNA分子进行序列特异性检测。由于CRISPR
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Cas系统中的sgRNA具有极强的可设计性，因此可以通过简单更改sgRNA序列以检测不同的目标序列核酸分子。
[0004]表面等离子共振技术，英文简写SPR，是从20世纪90年代发展起来的一种高灵敏度光学检测技术，利用该技术研制出的SPR传感器是一种高分辨率光学折射率传感器，可以用于检测折射率极为微小的变化。利用SPR原理开发的生物传感器可以被视为“超微量天平”用于检测分析生物分子之间相互作用的情况，并已被广泛应用于诸如大分子检测、药物筛选、蛋白质相互作用、临床诊断、细胞膜模拟、遗传分析等多个领域。但是目前尚无将CRISPR技术和表面等离子共振技术联合用于检测核酸。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面的目的，在于提供一种检测核酸的CRISPR
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SPR生物传感器芯片。
[0006]本专利技术的第二方面的目的，在于提供第一方面的CRISPR
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SPR生物传感器芯片的制备方法。
[0007]本专利技术的第三方面的目的，在于提供一种包含本专利技术第一方面的CRISPR
‑
SPR生物
传感器芯片的CRISPR
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SPR检测系统。
[0008]本专利技术的第四方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的CRISPR
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SPR生物传感器芯片和/或本专利技术第三方面的CRISPR
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SPR检测系统在检测核酸中或制备检测核酸的产品中的应用。
[0009]本专利技术的第五方面的目的，在于提供一种检测核酸的方法。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0011]本专利技术的第一个方面，提供一种检测核酸的CRISPR
‑
SPR生物传感器芯片，包含：SPR生物传感器芯片、固定于所述SPR生物传感器芯片表面的Cas蛋白、与所述Cas蛋白结合的sgRNA；所述核酸的序列包含靶核酸序列；所述sgRNA包含向导序列和锚定序列，所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补，所述锚定序列与所述Cas蛋白特异性结合。
[0012]优选地，所述Cas蛋白包括dCas9、Cas9、Cas12a、dCas12a、Cas13a和dCas13a中的至少一种；进一步优选地，所述Cas蛋白包括dCas9。
[0013]优选地，所述dCas9(dead Cas9)、dCas12a(dead Cas12a)、dCas13a(dead Cas13a)分别由Cas9、Cas12a、Cas13a改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)。
[0014]优选地，所述sgRNA从5
’
端到3
’
端依次包含向导序列和锚定序列。
[0015]优选地，所述sgRNA的长度为40～120bp。
[0016]优选地，所述sgRNA的向导序列的长度为8～35bp；进一步为16～23bp。
[0017]优选地，所述sgRNA的5
’
端还包含GGG。
[0018]优选地，所述核酸包括DNA和RNA中的至少一种。
[0019]优选地，所述DNA包括ssDNA和dsDNA中的至少一种。
[0020]优选地，所述核酸来自动物、植物或微生物样品。
[0021]优选地，所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
[0022]优选地，所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
[0023]优选地，所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
[0024]优选地，所述SPR生物传感芯片是一种基底为高透光玻璃且表面具有纳米级贵金属镀层的光学芯片。
[0025]优选地，所述贵金属包括金、银、铜中的至少一种。
[0026]优选地，所述SPR生物传感器芯片可以通过市购得到，也可以采用本领域常规方法制备得到。
[0027]优选地，所述SPR生物传感芯片是通过物理气相沉积(PVD)法在厚度为50～300μm的高透光玻璃片表面沉积厚度为40～50nm的贵金属镀层制备而得。
[0028]优选地，所述SPR生物传感器芯片为经非金属材料修饰的SPR生物传感器芯片。
[0029]优选地，所述非金属材料包括碳衍生物。
[0030]优选地，所述碳衍生物包括石墨炔、石墨烯、石墨和富勒烯中的至少一种；进一步优选地，所述碳衍生物包括石墨炔和石墨烯中的至少一种；更进一步优选地，所述碳衍生物
包括石墨炔。
[0031]优选地，所述SPR生物传感器芯片为经石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片。
[0032]优选地，所述经石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸的CRISPR
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SPR生物传感器芯片，包含：SPR生物传感器芯片、固定于所述SPR生物传感器芯片表面的Cas蛋白、与所述Cas蛋白结合的sgRNA；所述核酸的序列包含靶核酸序列；所述sgRNA包含向导序列和锚定序列，所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补，所述锚定序列与所述Cas蛋白特异性结合。2.根据权利要求1所述的CRISPR
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SPR生物传感器芯片，其特征在于：所述Cas蛋白的质量与所述SPR生物传感器芯片的表面积的比例为(1～10)ug：400mm2。3.根据权利要求2所述的CRISPR
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SPR生物传感器芯片，其特征在于：所述Cas蛋白与所述sgRNA的质量比为(1～25)：5；优选地，所述核酸包括DNA和RNA中的至少一种；优选地，所述核酸来自动物、植物或微生物样品。4.根据权利要求1～3中任一项所述的CRISPR
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SPR生物传感器芯片，其特征在于：所述SPR生物传感器芯片为经非金属材料修饰的SPR生物传感器芯片；优选地，所述非金属材料包括碳衍生物；优选地，所述碳衍生物包括石墨炔、石墨烯、石墨和富勒烯中的至少一种。5.权利要求1～4中任一项所述的CRISPR
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SPR生物传感器芯片的制备方法，将所述Cas蛋白通过(a1)～(a3)中任一种方式固定于所述SPR生物传感器芯片表面，然后与所述sgRNA孵育，得到；(a1)共价键；(a2)生物素
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链霉亲和素；(a3)His标签
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His抗体或His标签
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镍
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NTA。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晗，陈挚，郑斐，谢中建，李景枫，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：