一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器技术方案

本发明专利技术提供一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器


[0001]本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器。

技术介绍

[0002]四环素在牛奶中根据食品安全国家标准(GB 31650
‑
2019)允许的残留量为100 μg
·
kg
‑1，在蜂蜜中根据食品安全国家标准(GB 14963
‑
2011)允许的残留量为20 μg
·
mL
‑1。目前用于检测四环素残留的传统方法有液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。传统检测方法需要大型仪器且耗时较长检测线较高等缺点。生物传感器方法主要有荧光适配体传感器、比色适配体传感器等；荧光适配体传感器荧光染料存在抗光漂白性差、荧光性能易受外界因素影响，比色适配体传感器金纳米粒子容易受到盐粒子的影响, 出现非特异性聚集变色现象表现出实验结果不稳定的现象；现有技术如高效液相色谱四环素检出限为0.125 mg/kg，相对标准偏差在5%以内；荧光适配体传感器在最佳条件下, 四环素的检测线性范围为0.01~100 ng/mL, 检出限 (LOD) 为0.0062 ng/mL。
[0003]在四环素的检测中急需一种检测范围宽，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定的生物传感器。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对上述问题，提供一种基于CRISPR
>‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器。本专利技术提供的生物传感器检测范围宽（50 μg/mL
‑
50 fg /mL），检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，其组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；所述的aptamer76链的碱基序列为：5
’‑
CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG
‑3’
；所述的trigger链的碱基序列为：5
’‑
CACGTGGAGCTCGAATTCCGTACG
‑3’
；所述sgRNA的碱基序列为：5'
‑
UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC CGU ACG GAA UUC GCU AGU CCG AGC UCC ACG UG
‑
3'所述FQ链的碱基序列为：5
’‑
FAM
‑
TTTTTTTTTTTT
‑
BHQ1
‑3’
。
[0006]上述基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）二元复合物探针构建：所述二元复合物探针由aptamer76链与trigger链杂交
而成；（2）四环素与二元复合物探针反应：将步骤（1）所构建的二元复合物探针与四环素均匀混匀孵育；（3）均相反应：将Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链、四环素与二元复合物探针的混合液加入到均相中，混合均匀后孵育；（4）荧光仪检测化学发光强度。
[0007]上述荧光生物生物传感器的制备方法中所述步骤（1）中aptamer76链与trigger链的浓度比为1.5:1。
[0008]上述的荧光生物生物传感器在四环素检测中的应用。
[0009]本专利技术基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器的技术原理：CRISPR
‑
Cas14a能够识别ssDNA从而激活Cas14a的非特异性切割单链活性；在此专利技术中识别的ssDNA就是trigger链，切割的单链就是FQ链；aptamer76链是可以特异性识别四环素小分子的适配体，trigger链是根据碱基互补配对原则设计的与aptamer76链结合的ssDNA, 当小分子物质四环素（TC）存在时，四环素与aptamer76链特异性结合从而使得trigger链被释放，sgRNA能够识别trigger导致Cas14a的非特异性切割单链活性被激活，FQ链被切割，在483nm
‑
525nm处能够观察到绿色荧光（图1）。
[0010]本专利技术的优点在于：本专利技术提供一种基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的传感器，该生物传感器用于检测四环素，其检测范围宽至50 μg/mL
‑
50 fg/mL，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。
[0011]附图说明:图1本专利技术的技术路线图。
[0012]图 2为四环素样本(阳性样本）测定结果图。左图为：通过实时荧光PCR仪测定的四环素样本(阳性样本）的曲线图，右图为：此样本在蓝光切胶仪下拍摄的图片。
[0013]图3为UP水为样本(阴性样本）的测定结果图。左图为：通过实时荧光PCR仪测定的以UP水为样本(阴性样本）的曲线图，右图为：此样本在蓝光切胶仪下拍摄的图片。
[0014]图4为aptamer76链与trigger链的不同比例结合的核酸电泳图。1
‑
6泳道对应表1中编号1
‑
6的不同浓度比例。
[0015]图5为不同浓度的标准四环素水溶液测定结果图。上图为蓝光切胶仪下拍摄的图；下图为蓝光切胶仪下拍摄后用Image J处理的图。从左至右：十一个样品对应表2中1
‑
11的不同样本。
[0016]图6为检测不同浓度的标准四环素水溶液2h后荧光终点值所做的柱状图。
具体实施方式
[0017]下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明。但本专利技术并不限于以下实施例。本专利技术采用的原料可在市场购得，或可用本领域已知的方法合成。
[0018]实施例1一种基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，所述荧光生物传感器的组成包括：四环素特异性适配体aptamer76、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；
所述四环素特异性适配体aptamer76的碱基序列为：5
’‑
CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
‑
Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器的组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；所述的aptamer76链的碱基序列为：5
’‑
CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG
‑3’
；所述的trigger链的碱基序列为：5
’‑
CACGTGGAGCTCGAATTCCGTACG
‑3’
；所述sgRNA的碱基序列为：5'
‑
UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC CGU...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芳，黄淑琴，白榕，李小晶，翁齐彪，付才力，张晓婷，
申请(专利权)人：长乐聚泉食品有限公司，
类型：发明
国别省市：