一种具有群体感应特征的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有群体感应特征的启动子及其应用，具有与SEQ ID NO.1所示的序列同源性≥95％的核酸序列，本发明专利技术提供的启动子Ptr1来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BL2)。本发明专利技术所述启动子具有前期(1

【技术实现步骤摘要】
一种具有群体感应特征的启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种具有群体感应特征的启动子及其应用。

技术介绍

[0002]地衣芽孢杆菌是工业产品的重要生产菌株，它能够高效合成蛋白，培养条件较为简单，且是食品安全菌株，自1972年起，它就已经被安全地用于淀粉酶的大规模工业生产。同时地衣芽孢杆菌还能产生丰富的次级代谢产物，如脂肽类化合物、羊毛硫抗生素等，极具研究价值和潜力。但地衣芽孢杆菌中高效表达元件严重匮乏等问题，也限制了其应用价值。目前对地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌的表达元件开发主要集中在高效启动子的筛选方面。目前芽孢杆菌中常见的诱导型启动子有Pgrac(IPTG诱导)、PspaS(枯草菌素诱导)、PxylA(木糖诱导)、Pglv(麦芽糖诱导)和PsacB(蔗糖诱导)，常见的组成型启动子有P43、 Pshuttle
‑
09等。
[0003]由于发酵过程的多样性和复杂性，目前的组成型启动子和诱导型启动子在应用中仍存在如：诱导剂成本较高，组成型启动子无法在特定条件下开启等问题。已有研究挖掘和开发具有更多样化的启动子，如Yu.等采用基于基因组规模微阵列的方法来鉴定启动子，鉴定出在不存在诱导剂的情况下，能够在平衡期高水平表达靶基因的启动子Pylb，以实现平衡期目标产物的高效生产；Yule Yue Wang 等在枯草芽孢杆菌发现了高效启动子vegGP，并实现了该启动子在大肠杆菌中异源基因的分级表达；Lu Xiao等克隆了解淀粉芽孢杆菌α
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淀粉酶基因的启动子和信号肽编码序列，并将其融合到编码枯草杆菌蛋白酶DFE的前肽和成熟肽的序列上，实现了枯草杆菌蛋白酶的高效表达。
[0004]群体感应是细胞种间的一种交流方式，能够使细胞在达到一定种群数量后改变群体的基因表达，即在低细胞密度时目的基因不表达，高细胞密度时目的基因开启表达，是一种基于细胞密度的自诱导系统。群体感应系统的调控与表达与发酵工程对动态代谢产物调控的需求相契合，且其开启表达不需要诱导剂。与组成型启动子不同，这类表达元件确保细菌种群达到一定数量后才产生目标产物，保证了细胞在“生长”与“生产”两相之间进行适时的转变。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均存在QS系统，如费氏弧菌(Vibrio fischeri)中的 LuxI/LuxR系统，和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的Agr系统，都是较为典型的QS系统。QS系统常常包括一个操纵子(包含四个基因)和一个多个受调控的启动子。如金黄色葡萄球菌中Agr QS系统调控元件为agrABCD四个基因，其中agrD编码自诱导肽，agrB编码加工、转运蛋白，使自诱导肽成为成熟的AIP信号分子，agrCA是双组分磷酸激酶系统(TCS)，当胞外信号分子达到一定浓度时识别并传递信号，从而结合在启动子P2和P3上，从而开启调控元件自身的表达和毒力基因的表达。
[0005]ComP
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ComA系统和Phr
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Rap系统是枯草芽孢杆菌内源的QS系统，其中 ComP
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ComA系统参与调控多个细胞行为，包括菌体感受态形成、生物膜的形成、胞外降解酶产生、抗生素和胞外多糖的产生、脂肪酸的代谢和运输等行为。在 ComP
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ComA系统中，随着细胞的生长，
两种信号肽ComX和CSF积累到阈值水平，以激活由双组分调节蛋白ComP和ComA组成的信号转导系统。最后，磷酸化的ComA与srf操纵子(PsrfA)的启动子结合以启动下游基因的转录。近年来，群体感应系统中的启动子作为一种新型表达元件，引入到合成生物学的工程应用研究，并且将其广泛运用在医学、工业、环境等应用领域，如 Chengran Guan等开发了一种包含srfA启动子(PsrfA)的自动诱导表达系统，并P23启动子表达系统，使其在不能形成孢子的枯草芽孢杆菌突变株中实现高细胞密度发酵。
[0006]目前地衣芽孢杆菌内源具有群体感应特性的启动子未见报道。地衣芽孢杆菌作为一种优良的工业菌株，开发其内源表达元件，扩展其启动子文库具有较大意义。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种具有群体感应特征的启动子及其应用。本专利技术启动子是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节目的基因表达的群体感应表达元件。本专利技术通过将具有群体感应特征的启动子构建到表达载体上，构建地衣芽孢杆菌群体感应表达系统，当细胞到达一定密度时表达元件才开始表达，避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种具有群体感应特征的启动子，具有与SEQ ID NO.1所示的序列同源性≥ 95％的核酸序列。
[0010]具体的，SEQ ID NO.1的序列为:
[0011]5’‑
TTTATGTATAGATATTTTCGAATATTTAACTTATTGGACACAATAATTTT GAAATAGGGCATTTTGCACAAGAAATAATCCAAAATAGCCCAAAAATAA TCCAACAATTCTAATTATTGTTATAATAATGCTGAGCTCCCAAAATTAATTAA GAGGTGAAGGAAA
‑3’
。
[0012]进一步的，上述具有群体感应特征的启动子，来源于地衣芽孢杆菌基因组。
[0013]进一步的，所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis BL
‑
2。
[0014]进一步的，上述具有群体感应特征的启动子，所述启动子具有前期表达弱，后期表达脉冲型增长的特性。
[0015]进一步的，上述具有群体感应特征的启动子，所述前期为菌体培养≤5h，所述后期为菌体培养≥16h，所述启动子的表达强度峰值不低于组成型启动子 Pshuttle
‑
09的30倍。
[0016]一种表达载体，包含所述的具有群体感应特征的启动子。
[0017]优选的，所述的表达载体将基于一种具有群体感应特征的启动子构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达。
[0018]优选的，表达载体为pHY300。
[0019]一种基因工程菌，包含上述具有群体感应特征的启动子或者上述表达载体。
[0020]进一步的，上述基因工程菌利用具有群体感应特征的启动子实现当细胞达到一定密度后，开启绿色荧光蛋白表达的功能。
[0021]优选的，所述绿色荧光蛋白为eGFP。
[0022]进一步的，上述一定密度为菌体OD600值≥6。
[0023]进一步的，上述基因工程菌来源于地衣芽孢杆菌。
[0024]进一步的，上述具有群体感应特征的启动子在无诱导剂的高密度发酵中的应用。
[0025]本专利技术有益的技术效果在于：
[0026]本专利技术克服现有发酵过程中对诱导剂的依赖，提供一种地衣芽孢杆菌内源的具有群体感应特征的启动子及其应用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，具有与SEQ ID NO.1所示的序列同源性≥95％的核酸序列。2.根据权利要求1所述的一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述启动子来源于地衣芽孢杆菌基因组。3.根据权利要求1所述的一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述启动子具有前期表达弱，后期表达脉冲型增长的特性。4.根据权利要求3所述的一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述前期为菌体培养≤5h，所述后期为菌体培养≥16h，所述启动子的表达强度峰值不低于组成型启动子Pshuttle
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09的30倍。5.一种表达载体，其特征在于，包含如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李由然，石贵阳，陈媛，张梁，丁重阳，徐沙，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：