一种靶向削减耐药基因bla制造技术

一种靶向削减耐药基因bla

【技术实现步骤摘要】
一种靶向削减耐药基因bla
TEM
及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及靶向bla
TEM
耐药基因及其耐药质粒的gRNA、一种可水平转移的基因敲除载体及其在bla
TEM
耐药质粒削减方面的应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着抗生素的大量使用，越来越多的抗生素及其代谢产物被排放入污水处理系统甚至自然环境中，使得这些环境中的微生物所面临的选择性压力也日益增加。这些残留的抗生素会使得细菌不断适应并进化，进而获得抗生素耐药性。抗生素耐药性往往由耐药基因决定，这些耐药基因可位于染色体及质粒上，并通过基因垂直转移和水平转移等方式进行传播。目前，耐药基因已被视为一种新型的环境污染物。耐药基因bla
TEM
在环境中普遍存在，它编码的广谱β
‑
内酰胺酶可以使氨苄西林等β
‑
内酰胺类抗生素水解，赋予细菌抗生素耐药性。目前，耐药基因bla
TEM
在多重耐药质粒上被广泛检出，这些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性靶向抗生素耐药基因bla
TEM
及携带bla
TEM
耐药质粒的gRNA，其特征在于，其编码的核苷酸序列为gRNA
TEM
‑
1：5
’‑
ATCGAACTGGATCTCAACAG
‑3’
，gRNA
TEM
‑
2：5
’‑
ACAATTAATAGACTGGATGG
‑3’
。2.一种可水平转移的敲除载体pCas9
‑
Mob，其特征在于，所述载体包含敲除蛋白基因Cas9，gRNA表达序列，水平转移位点OriT。3.含有权利要求1所述特异性靶向耐药基因bla
TEM
及携带bla
TEM
多重耐药质粒的gRNA
TEM
‑
1、gRNA
TEM
‑
2的可转移型基因敲除载体pCas9
‑
Mob
‑
gRNA
TEM
‑
1或pCas9
‑
Mob
‑
gRNA
TEM
‑
2。4.一种构建权利要求3所述的基因敲除载体pCas9
‑
Mob
‑
gRNA
TEM
‑
1或pCas9
‑
Mob
‑
gRNA
TEM
‑
2的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据权利要求1所述的gRNA
TEM
‑
1和gRNA
TEM
‑
2序列设计退火引物，分别为：gRNA
TEM
‑
1正向引物：5
’‑
AAACATCGAACTGGATCTCAACAGG
‑3’
gRNA
TEM
‑
1反向引物：5
’‑
AAAACCTGTTGAGATCCAGTTCGAT
‑3’
gRNA
TEM
‑
2正向引物：5
’‑
AAACACAATTAATAGACTGGATGGG
‑3’
gRNA
TEM
‑
2反向引物：5
’‑
AAAACCCATCCAGTCTATTAATTGT
‑3’
(2)将gRNA
TEM
‑
1和gRNA
TEM
‑
2的正向引物和反向引物分别退火，形成双链，并用T4 PNK酶磷酸化；(3)利用无缝克隆技术将质粒水平转移位点OriT插入pCas9质粒中，构建可转移的pCas9
‑
Mob质粒，利用核酸内切酶将其线性化，并凝胶回收；(4)利用T4连接酶将磷酸化后的gRNA
TEM
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，林泽俊，周振超，朱琳，帅馨怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：