本发明专利技术提供了用于CRISPANT特异性敲除斑马鱼hectd4基因构建斑马鱼癫痫模型的sgRNA组合，其序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，通过CRISPANT技术，敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，选育出hectd4基因缺失型斑马鱼，从而构建斑马鱼癫痫模型。本发明专利技术使用多个sgRNA靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，更有效进行基因编辑。本发明专利技术提供的斑马鱼癫痫模型为进一步开展HECTD4突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定了很好的基础。了很好的基础。了很好的基础。
【技术实现步骤摘要】
一种hectd4基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用
[0001]本专利技术涉及基因敲除
，具体涉及一种hectd4基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用。
技术介绍
[0002]CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。研究人员发现使用多个sgRNA靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，并将这种方法命名为CRISPANT技术。
[0003]在前期的癫痫患者的全外显子组测序(WES)结果中，筛选到可能引起癫痫疾病的基因HECTD4。斑马鱼作为脊椎动物，具有复杂的神经系统，遗传结构与人类相似，约70％的基因与人类共享，约84％的人类疾病已知相关基因也在斑马鱼中表达。与小鼠等啮齿类动物相比，斑马鱼遗传操作简单，更适合用于制备癫痫模型。且hectd4基因进化上较为保守，研究发现hectd4在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。因此，本专利技术旨在利用CRISPANT技术建立hectd4基因敲除斑马鱼癫痫模型，该斑马鱼系可用于研究HECTD4突变与癫痫发病机制的关系及后续抗癫痫药物筛选。
技术实现思路
[0004]本专利技术提供了用于CRISPANT特异性敲除斑马鱼hectd4基因构建斑马鱼癫痫模型的sgRNA组合，通过CRISPANT技术，选育出hectd4基因缺失型斑马鱼，从而构建斑马鱼癫痫模型。
[0005]本专利技术采用以下技术方案：
[0006]本专利技术第一方面提供了一种sgRNA组合，所述sgRNA组合是用于CRISPANT特异性敲除斑马鱼hectd4基因构建斑马鱼癫痫模型的sgRNA组合，其序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。
[0007]进一步地，所述敲除斑马鱼hectd4基因是敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，其序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]本专利技术第二方面提供了一种斑马鱼癫痫模型，所述斑马鱼癫痫模型是利用上述sgRNA组合敲除斑马鱼hectd4基因来构建。
[0009]进一步地，所述敲除斑马鱼hectd4基因是敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，其序列如SEQ ID NO.7所示。
[0010]本专利技术第三方面提供了一种构建斑马鱼癫痫模型的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的sgRNA组合。
[0011]进一步地，还包括Cas9蛋白。
[0012]本专利技术第四方面提供了上述sgRNA组合在构建斑马鱼癫痫模型中的应用，是利用所述sgRNA组合敲除斑马鱼hectd4基因来构建斑马鱼癫痫模型。
[0013]进一步地，所述敲除斑马鱼hectd4基因是利用所述sgRNA组合敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，其序列如SEQ ID NO.7所示。
[0014]本专利技术第五方面提供了上述斑马鱼癫痫模型在筛选抗癫痫药物中应用。
[0015]本专利技术第六方面提供了一种斑马鱼癫痫模型的构建方法，包括如下步骤：
[0016]1)、靶向CRISPANT基因的sgRNA组合和检测引物的筛选：sgRNA组合序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，检测引物序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；
[0017]2)、将4个sgRNA和Cas9蛋白混合物注射到斑马鱼的受精卵中；
[0018]3)、F0代突变斑马鱼筛选：筛选出敲除有效的胚胎，培养至成鱼，获得F0代突变斑马鱼；
[0019]4)、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代：将F0代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，筛选存在突变的胚胎，培养至成鱼，筛选得到可遗传的斑马鱼突变体的F1代。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术提供了用于CRISPANT特异性敲除斑马鱼hectd4基因构建斑马鱼癫痫模型的sgRNA组合，通过CRISPANT技术，敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，选育出hectd4基因缺失型斑马鱼，从而构建斑马鱼癫痫模型。
[0022]本专利技术使用多个sgRNA靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，更有效进行基因编辑。
[0023]本专利技术提供的斑马鱼癫痫模型为进一步开展HECTD4突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定了很好的基础。
附图说明
[0024]图1为CRISPR/Cas9敲除原理图。
[0025]图2为hectd4基因上打靶位点在基因组上的序列位置图。
[0026]图3为4条sgRNA电泳检测图(M表示为DNA Marker，从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp；编号1、2、3、4分别为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4)。
[0027]图4为4条sgRNA活性验证电泳图(M表示为DNA Marker，从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp；编号1、2、3为sgRNA1单靶注射后胚胎，编号4、5、6为sgRNA2单靶注射后胚胎，编号7、8、9为sgRNA3单靶注射后胚胎，编号10、11、12为sgRNA4单靶注射后胚胎，WT为野生型)。
[0028]图5为hectd4 F0代基因型鉴定电泳图(M表示为DNA Marker，从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp；编号1
‑
17表示为F0代剪鱼尾序号，WT为野生型)。
[0029]图6为hectd4 F1代基因型鉴定电泳图(M表示为DNA Marker，从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp；编号1
‑
12表示为F1代剪鱼尾序号，WT为野生型)。
[0030]图7为hectd4 F1代野生型与突变体测序峰图对比。
具体实施方式
[0031]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0032]实施例1
[0033]1)设计CRISPANT基因敲除靶位点和检测引物
[0034]在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼hectd4基因的基因组DNA序列(基因编号为：XM_009303668)，根据CRISPR/Cas9敲除原理(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种sgRNA组合，其特征在于，所述sgRNA组合是用于CRISPANT特异性敲除斑马鱼hectd4基因构建斑马鱼癫痫模型的sgRNA组合，其序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的一种sgRNA组合，其特征在于，所述敲除斑马鱼hectd4基因是敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，其序列如SEQ ID NO.7所示。3.一种斑马鱼癫痫模型，其特征在于，所述斑马鱼癫痫模型是利用权利要求1所述的sgRNA组合敲除斑马鱼hectd4基因来构建。4.根据权利要求3所述的一种斑马鱼癫痫模型，其特征在于，所述敲除斑马鱼hectd4基因是敲除斑马鱼hectd4基因第二个外显子上58bp片段，其序列如SEQ ID NO.7所示。5.一种构建斑马鱼癫痫模型的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的sgRNA组合。6.根据权利要求5所述的一种构建斑马鱼癫痫模型的试剂盒，其特征在于，还包括Cas9蛋白。7.权利要求1所述的sgRNA组合在构建斑马鱼...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘乐，刘静，
申请(专利权)人：浙江赛微思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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