一种生物标记物、其检测方法以及其在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用技术

本发明专利技术提供一种生物标记物、其检测方法以及其在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用，该生物标记物与斑马鱼癫痫病理特征相关，所述生物标记物为神经激发簇；所述的神经激发簇是对斑马鱼进行GCaMP荧光动态成像获取的图像数据进行MATLAB分析时，获取的时间和空间上均相邻的神经激发团的合集；所述神经激发团是在单帧图像中至少三个相连的激发态像素点的合集。本发明专利技术结合GCaMP动态成像技术和斑马鱼遗传性癫痫模型，采用基于MATLAB的图像数据处理管线对数据进行可视化以及量化分析，以局部神经激发簇作为癫痫生物标记物，实现神经系统癫痫病理情况的高效判断，具有快速、客观、准确等优点，可用于进行高通量抗癫痫药物筛选。可用于进行高通量抗癫痫药物筛选。可用于进行高通量抗癫痫药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种生物标记物、其检测方法以及其在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种生物标记物、其检测方法以及其在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用。

技术介绍

[0002]目前，基于斑马鱼的癫痫模型被广泛用于癫痫病理机制研究和抗癫痫药物筛选。
[0003]基于斑马鱼的癫痫模型通常使用运动轨迹或电生理信号作为癫痫的生物标记物来进行癫痫发生的判断和抗癫痫药物的药效评估，但此类方法仅适用于表现出稳定高频率癫痫的模型，如化学诱导癫痫模型及scn1Lab突变的Dravet综合症模型，其癫痫发生率约为80％，癫痫发生频率约为1次/分钟。
[0004]然而，其他斑马鱼遗传性癫痫模型表现出较低的癫痫发生率和发生频次，比如stxbp1b突变模型，其癫痫发生率约为20％，癫痫发生频率约为1次/20分钟。通过传统方法进行观测既耗时又低效，也难以实现高通量药物筛选。
[0005]因此迫切需要一个高效易观察的生物学指标来反映斑马鱼癫痫神经网络的病理特征以便进行疾病判断和药物筛选。近年来，神经系统特异性表达GCaMP的荧光品系斑马鱼被用于观察全脑范围的神经网络动态，为寻找高效的癫痫生物标记物提供了创新的技术平台。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术中具有较低癫痫发生率和发生频次的斑马鱼癫痫模型不易观察癫痫发生情况的不足，提供了一种生物标记物及其检测方法，该生物标记物能够高效判断癫痫病理情况，该方法具有快速、客观、准确等优点。
[0007]为达成上述目的，本专利技术提出如下技术方案：
[0008]一种生物标记物，该生物标记物与斑马鱼癫痫病理特征相关，所述生物标记物为神经激发簇；
[0009]所述的神经激发簇是对斑马鱼进行GCaMP荧光动态成像获取的图像数据进行MATLAB分析时，获取的时间和空间上均相邻的神经激发团的合集；所述神经激发团是在单帧图像中至少三个相连的激发态像素点的合集；
[0010]所述激发态像素点定义如下：设定一激活态阈值，对所获取的斑马鱼视顶盖脑区所有像素点的荧光强度随时间变化的数据进行分析，若某个像素点的荧光强度在某时刻超过设定的激活态阈值，则该像素点在此时刻为激发态像素点。
[0011]作为优选，所述的激活态阈值为该像素点荧光强度基线标准方差的5倍。
[0012]作为优选，斑马鱼为神经元特异性表达GCaMP的转基因荧光品系。
[0013]作为优选，斑马鱼为转基因荧光品系Tg(neurod1:GCaMP6f)。
[0014]作为优选，斑马鱼为基因突变斑马鱼。
[0015]作为优选，基因突变斑马鱼为stxbp1b基因突变斑马鱼。
[0016]生物标记物的检测方法，包括以下步骤：
[0017]步骤一：将斑马鱼背部朝上固定于共聚焦成像系统载物台的样品槽内，进行GCaMP荧光动态成像，记录图像数据；
[0018]步骤二：将所述的图像数据导入MATLAB进行分析，记录不同时间点斑马鱼视顶盖脑区像素点的荧光强度，得到不同像素点荧光强度随时间变化的数据；
[0019]步骤三：对所获取的像素点数据进行二进制化处理，设定一激活态阈值，若单个像素点的荧光强度在某时刻超过该激活态阈值，设为激发态1，若单个像素点的荧光强度在某时刻未超过该激活态阈值，设为非激发态0，以此形成二进制字符串；
[0020]定义在单帧图像中至少三个相连的激发态像素点的合集为神经激发团，定义时间和空间上均相邻的神经激发团的合集为神经激发簇；
[0021]该神经激发簇即所述的生物标记物。
[0022]作为优选，所述的激活态阈值为该像素点荧光强度的基线标准方差的5倍。
[0023]作为优选，所述图像数据获取频率不低于20帧/秒，连续记录3
‑
5分钟。
[0024]作为优选，所述图像数据获取频率为20帧/秒，连续记录5分钟。
[0025]本专利技术还提供了上述生物标记物在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用，能够高效准确地判断癫痫病理情况，能够快速进行高通量抗癫痫药物筛选。
[0026]上述的生物标记物在癫痫病理研究中的应用。
[0027]作为优选，生物标记物在癫痫病理研究中的应用，包括以下步骤：
[0028]步骤一：将斑马鱼背部朝上固定于共聚焦成像系统载物台的样品槽内，进行GCaMP荧光动态成像，记录图像数据；
[0029]步骤二：将所述的图像数据导入MATLAB进行分析，记录不同时间点斑马鱼视顶盖脑区像素点的荧光强度，得到不同像素点荧光强度随时间变化的数据；
[0030]步骤三：对所获取的像素点数据进行二进制化处理，设定一激活态阈值，若单个像素点的荧光强度在某时刻超过该激活态阈值，设为激发态1，若单个像素点的荧光强度在某时刻未超过该激活态阈值，设为非激发态0，以此形成二进制字符串；
[0031]定义在单帧图像中至少三个相连的激发态像素点的合集为神经激发团，定义时间和空间上均相邻的神经激发团的合集为神经激发簇；
[0032]当算法在当前帧识别到在前一帧图像中未出现过的激发团，此处计为神经激发簇起始时间点T1，当算法在下一帧识别到与当前帧激发团在空间上相连的激发团，该神经激发簇持续进行，否则此处计为该神经激发簇终止时间点T2，记录神经激发簇数量并计算时长：
[0033]神经激发簇时长＝T2–
T1；
[0034]定义神经激发簇大小为从神经激发簇起始到结束所有激发态像素点的累计数量；
[0035]根据图像数据中识别到的所有神经激发簇大小和神经激发簇时长绘制图像，进行量化分析；
[0036]通过比较斑马鱼脑部神经激发簇大小和神经激发簇时长，分析斑马鱼癫痫的病理情况。
[0037]作为优选，所述的激活态阈值为该像素点荧光强度的基线标准方差的5倍。
[0038]作为优选，所述图像数据获取频率不低于20帧/秒，连续记录3
‑
5分钟。
[0039]作为优选，所述图像数据获取频率为20帧/秒，连续记录5分钟。
[0040]上述生物标记物在抗癫痫药物筛选中的应用。
[0041]作为优选，上述生物标记物在抗癫痫药物筛选中的应用，包括以下步骤：
[0042]步骤一：将斑马鱼背部朝上固定于共聚焦成像系统载物台的样品槽内，进行GCaMP荧光动态成像，记录图像数据；
[0043]步骤二：在样本表面加入待评价药物溶液，等待30分钟，待药物渗入幼鱼体内，按上述方法再次进行成像记录。
[0044]步骤三：将两次记录的图像数据导入MATLAB进行分析，记录不同时间点斑马鱼视顶盖脑区像素点的荧光强度，得到不同像素点荧光强度随时间变化的数据；
[0045]步骤四：对所获取的像素点数据进行二进制化处理，设定一激活态阈值，若单个像素点的荧光强度在某时刻超过该激活态阈值，设为激发态1，若单个像素点的荧光强度在某时刻未超过该激活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物标记物，该生物标记物与斑马鱼癫痫病理特征相关，其特征在于：所述生物标记物为神经激发簇；所述的神经激发簇是对斑马鱼进行GCaMP荧光动态成像获取的图像数据进行MATLAB分析时，获取的时间和空间上均相邻的神经激发团的合集；所述神经激发团是在单帧图像中至少三个相连的激发态像素点的合集；所述激发态像素点定义如下：设定一激活态阈值，对所获取的斑马鱼视顶盖脑区所有像素点的荧光强度随时间变化的数据进行分析，若单个像素点的荧光强度在某时刻超过设定的激活态阈值，则该像素点在此时刻为激发态像素点。2.根据权利要求1所述的生物标记物，其特征在于：所述的激活态阈值为该像素点荧光强度的基线标准方差的5倍。3.根据权利要求1所述的生物标记物，其特征在于：斑马鱼为基因突变斑马鱼，且为神经元特异性表达GCaMP的转基因荧光品系。4.根据权利要求3所述的生物标记物，其特征在于：基因突变斑马鱼为stxbp1b基因突变斑马鱼。5.权利要求1
‑
4所述的生物标记物的检测方法，包括以下步骤：步骤一：将斑马鱼背部朝上固定于共聚焦成像系统载物台的样品槽内，进行GCaMP荧光动态成像，记录图像数据；步骤二：将所述的图像数据导入MATLAB进行分析，记录不同时间点斑马鱼视顶盖脑区像素点的荧光强度，得到不同像素点荧光强度随时间变化的数据；步骤三：对所获取的像素点数据进行二进制化处理，设定一激活态阈值，若单个像素点的荧光强度在某时刻超过该激活态阈值，设为激发态1，若单个像素点的荧光强度在某时刻未超过该激活态阈值，设为非激发态0，以此形成二进制字符串；定义在单帧图像中至少三个相连的激发态像素点的合集为神经激发团，定义时间和空间上均相邻的神经激发团的合集为神经激发簇；该神经激发簇即所述的生物标记物。6.根据权利要求5所述的生物标记物的检测方法，其特征在于：所述图像数据获取频率不低于20帧/秒，连续记录3
‑
5分钟。7.权利要求1
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4所述的生物标记物在癫痫病理研究中的应用。8.根据权利要求7所述的生物标记物在癫痫病理研究中的应用，包括以下步骤：步骤一：将斑马鱼背部朝上固定于共聚焦成像系统载物台的样品槽内，进行GCaMP荧光动态成像，记录图像数据；步骤二：将所述的图像数据导入MATLAB进行分析，记录不同时间点斑马鱼视顶盖脑区像素点的荧光强度，得到不同像素点荧光强度随时间变化的数据；步骤三：对所获取的像素点数据进行二进制化处理，设定一激活态阈值，若单个像素点的荧光强度在某时刻超过该激活...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静，梁萌萌，余伟师，
申请(专利权)人：浙江赛微思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：