一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法。所述方法包括如下步骤：1、去泛素化酶检测探针的制备，包括制备融合蛋白Ub

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别涉及到一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法。

技术介绍

[0002]泛素化修饰广泛存在于真核细胞中，泛素（Ubiquitin, Ub）所形成的“泛素密码”几乎可以调控所有的生理过程。泛素化修饰也是可逆的，泛素可被去泛素化酶（deubiquitinase, DUB）从底物或者泛素链中分解释放出来。去泛素化酶在泛素
‑
蛋白酶体通路、自噬通路等都起着调控作用，很多神经退行性疾病、肿瘤也与去泛素化酶有关，所以去泛素化酶是非常重要的药物靶点。检测去泛素化酶的活性是研究其生物学功能的重要途径，也是药物筛选的必要手段。目前，检测去泛素化酶活性的主要方法如下：通过检测蛋白质的分子量（SDS
‑
PAGE或者Western blot）来研究去泛素化酶的活性（Peterson LF等，Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 2015, 125(23): 3588<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）去泛素化酶检测探针的制备：
①
制备融合蛋白Ub
‑
linker
‑
Cys：将Ub
‑
linker
‑
Cys的基因序列克隆到pET11a载体上(Novagen)，酶切位点为NdeI和BamHI，以BL21 star为表达宿主，对该融合蛋白进行表达，当OD
600
达到0.6
‑
0.8时，加入终浓度为200
‑
1000μM IPTG ，在温度为25
‑
37
°
C诱导3
‑
6小时，在纯化Ub
‑
linker
‑
Cys融合蛋白时，依次用P Seoharose Fast Flow, Sephacryl S100以及Source
‑
S columns进行纯化获得高纯度的蛋白，融合蛋白Ub
‑
linker
‑
Cys的氨基酸序列以及基因序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
②
连接BODIPY探针：BODIPY
‑
maleimide探针的连接为现有技术，将Ub
‑
linker
‑
Cys蛋白置换到浓度为20 mM 磷酸盐缓冲液中,缓冲液的pH 为7.2
‑
8.0，以摩尔比1:2
‑
1:5分别加入蛋白质和BODIPY探针，室温反应1
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3小时，然后通过Source
‑
S columns进行纯化，连接上荧光探针的样品在280 nm、544 nm处均有吸收；
③
质谱检测：通过质谱对制备的Ub
‑
linker
‑
Cys融合蛋白进行检测，其检测结果与理论分子量10875.3 Da相一致，利用质谱对连接BODIPY探针后的样品进行检测，其质谱检测结果为11437.72 Da，该值正好为Ub
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linker
‑
Cys与BODIPY
‑
maleimide分子量之和，BOD...

【专利技术属性】
技术研发人员：易华伟，张嫦丽，王清清，范文，罗伟，辛陈琦，
申请(专利权)人：荆州市第一人民医院荆州市肿瘤医院，长江大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：