冠状病毒的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种冠状病毒的检测方法及试剂盒，所述检测方法，包括以下步骤：1)、样品采集；2)、提取样品中的病毒RNA；3)、以病毒RNA为模板，进行PCR扩增；4)、对PCR扩增产物使用质谱仪进行检测，并对结果进行判定；其中，步骤3)所述PCR扩增，需要使用引物和探针，这些引物和探针可用于检测7种人冠状病毒，它们是：人冠状病毒229E、NL63、HKU1、OC43、SARS

【技术实现步骤摘要】
冠状病毒的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体而言，涉及一种可以检测多种冠状病毒的检测方法并提供一种适用于所述检测方法的试剂盒，所述多种冠状病毒包括新型冠状病毒SARS
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CoV
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2分子分型与变异株。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Coronaviruses，CoVs)属于冠状病毒科，是自然界广泛存在、能够感染人和动物的一大类病毒家族，在电镜下观察其病毒粒子表面有类似日冕状的纤突而被命名。冠状病毒的基因组较大，其单股正链基因序列长达26～32kb，是已知自然界序列最长的RNA病毒。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS
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CoV
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2)引起的持续流行性新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID
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19)疫情最初爆发于2019年12月下旬，如今对全球公共卫生和经济构成了前所未有的威胁。SARS
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CoV
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2感染主要引起以肺部病变为主的呼吸道传染病，还可引起急性心肌损伤和急性呼吸窘迫综合征等严重的并发症，甚至导致死亡。尽管2003年出现的严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS
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CoV)和2012年出现中东呼吸道综合征冠状病毒(Middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS
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CoV)感染的死亡率比SARS
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CoV
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2高，但SARS
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CoV
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2的传播速度远高于MERS
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CoV和SARS
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CoV。截至2021年08月17日，已有200多个国家受到该病毒的影响，尽管采取了所有干预和控制措施，实验室确诊的COVID
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19病例数仍在增加，有超过2亿感染确诊例，死亡人数超过400万(https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda75947440fd40299423467b48e9ecf6)。
[0003]在全球疫情爆发的情况下，尽早(最好是在症状出现的最早阶段)地快速检测SARS
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CoV
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2的感染对控制病毒的传播具有至关重要的作用，尤其是SARS
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CoV
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2感染者的临床表现与流感等其他季节性呼吸道感染患者的临床表现非常相似，难以区分。
[0004]因此，迫切需要一种特异、敏感的SARS
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CoV
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2的检测、鉴定和筛查方法，以便在患者出现临床症状前的早期确定COVID
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19阳性病例。目前，SARS
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CoV
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2的检测主要采用两种诊断策略：一是通过分子诊断方法检测呼吸道标本(鼻咽拭子、咽拭子、唾液、痰液和下呼吸道分泌物)中的病毒RNA；二是使用血液样本检测特定抗体的血清学或抗体测试。血清学检测可监测患者在急性期(发病第一周)和恢复期(发病后2
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4周)的免疫反应和抗体生成。因此血清型检测特别适用于对COVID
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19感染的回顾性研究，而不适用于SARS
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CoV
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2早期感染的鉴定。自SARS
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CoV
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2基因组序列信息首次公布以来，一系列核酸扩增方法(Nucleic acid amplification testing，NAAT)凭借耗时短、操作简便、自动化等优点快速建立起来用于SARS
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CoV
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2病毒RNA的检测，包括下一代测序(NGS)、实时定量逆转录聚合酶链反应(RT
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PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和基于规则间隔短回文重复序列(CRISPR)机制的方法。在新冠疫情爆发初期，在不清楚致病病原体的情况下，NGS技术及时地识别和发现了病原体SARS
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CoV
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2。除了用于确认疑似COVID
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19病例外，NGS技术还可以帮
助我们监测SARS
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CoV
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2基因组中可能发生的突变，这对于了解SARS
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CoV
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2病毒的致病机制和进化具有重要意义。虽然NGS的价格逐年在降低，但是成本仍然很高，而且整个运行程序繁琐(包括耗时复杂的文库制备和数据处理)，需要专业的人员进行数据分析，并且一次可处理的样本有限，这些因素极大地限制了其在大规模爆发疫情中的应用。实时RT
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PCR检测SARS
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CoV
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2是一种特异性强、灵敏度高的检测方法，被世界卫生组织推荐为有效、简便的方法，同时也是当前研究和临床实验室鉴定COVID
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19大流行的金标准方法。虽然实时RT
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PCR检测已得到广泛应用，但全球范围内检测需求的增加导致试剂和相关耗材的短缺，从而影响到越来越多疑似COVID
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19感染的诊断。为了满足全球对SARS
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CoV
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2诊断的空前需求，许多替代方法，如LAMP、RPA和CRISPR，已经被开发出来，以实现对病毒RNA的同等的检测水平。虽然与NGS相比，这些检测方法能更快、更简便、成本更低廉和使用更少的时间来确诊COVID
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19，但它们不能提供SARS
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CoV
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2的亚型和突变信息。因此，迫切需要开发和建立一种综合的诊断方法，不仅可用于病毒鉴定，而且还可直接用于SARS
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CoV
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2基因组的分型和突变检测，及时为疫情防控提供信息。
[0005]质谱法(mass spectrometry,MS)是一种通过测量待测物离子的质荷比(m/z)从而实现对样品的定性和定量分析与鉴定的方法。质谱仪的基本工作原理是：首先样品中各组分的分子在离子源中发生电离，生成不同质荷比的离子(带正电荷或负电荷)；然后经过加速引出和传输调制电场，形成离子束，进入质量分析器；在质量分析器中，再利用电场和磁场对不同质荷比的离子的作用力不同，将他们按照质荷比的大小分别聚焦到离子探测器上，最后由信号记录系统得到这些离子的质谱图。随着电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于7种人冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其中含有用于检测SARS
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CoV
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2病毒分子分型与变异株的引物和探针，其序列为SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.16
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SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.31
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SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.43
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SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.61
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SEQ ID NO.63所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中含有用于检测人冠状病毒229E、NL63、HKU1、OC43、SARS
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CoV、MERS
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CoV以及SARS
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CoV
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2的引物和探针，其中，SARS
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CoV
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2病毒包括S、L、V、G、GH、GR、GV与GRY分型，以及英国变异株、南非变异株、巴西变异株，其序列为SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.63所示引物组与探针。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，根据需要，还可以包括检测用具和试剂，如PCR所需的试剂如溶剂，酶，对照品，所述用具可以包括，使用说明书，棉签，支架，试剂瓶，试纸等检测工作中必要的配套产品。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括反应buffer混合液，RNA逆转录酶与聚合酶，虾碱性磷酸酶反应组分，单碱基延伸反应组分。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中的引物及探针，以及所述试剂和用具，可以是满足检测1人次样本的用量，也可以是，满足多人次样本的用量。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述满足多人次样本的用量，可以是5人次，10人次，20人次，50人次，100人次，1000人次，以可以满足筛查需要来确定具体剂量。7.用于检测7种人冠状病毒的专用引物，选自：SEQ ID NO.28
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SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.25
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SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.55
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SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.58
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SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.52
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SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭俊平，李晓东，孙立莹，曹磊，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：