一种检测新型冠状病毒亚基因的荧光定量PCR方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种检测新型冠状病毒亚基因的荧光定量PCR方法及试剂盒。该试剂盒可敏感、特异的检测各种样本是否存在N亚基因，从而反映新型冠状病毒的感染性。同时试剂盒使用内标以质控核酸抽提及PCR反应过程，消除假阴性的产生，使整个检测过程实验准确可靠。使整个检测过程实验准确可靠。使整个检测过程实验准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型冠状病毒亚基因的荧光定量PCR方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒亚基因的荧光定量PCR方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]2019年12月爆发了新型冠状病毒肺炎(COVID
‑
19)疫情，引起该病的病原被鉴定为新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2或2019
‑
nCoV)。SARS
‑
CoV
‑
2是目前已知的第7种可感染人类的冠状病毒，也是新中国成立以来在我国发生的传播速度最快、感染范围最广、防控难度最大的一次重大突发公共卫生事件。据世界卫生组织专家推测，新冠肺炎疫情短期内不会消失，可能会出现多次反复，持续多年。
[0003]新型冠状病毒感染人的致病机理未完全阐明，人体感染病毒后可在长达2个月左右时间检测到病毒核酸，肛拭子检测阳性时间则更长。还有约10％左右病例在治疗病毒转阴出院后又出现核酸“复阳”情况，判定这些感染后期或“复阳”样本中病毒是否具有感染性对于病例的治疗、管理具有非常重要的意义。
[0004]目前对新型冠状病毒的检测方法包括Real
‑
time PCR、等温扩增方法检测病毒ORF1a/b、N、E等基因，磁化学发光、免疫层析、ELISA等方法检测病毒抗原或抗体，全基因组测序以及病毒分离培养。其中病毒分离培养可以明确病毒的感染性，但需要在生物安全3级(BSL
‑
3)实验室开展，耗时较长，且敏感性较差。而Real
‑
time PCR等检测方法虽然快速、敏感，但不能判定病毒的感染性，对于已灭活的死病毒也可无差异检测。因而，急需一种能快速检测病毒感染性的方法。
[0005]新型冠状病毒在复制过程中会产生亚基因组，亚基因组在结构上由病毒5
’
UTR区Leader序列及各基因转录RNA片段构成，亚基因组的出现可反应病毒复制状态，从而代表病毒的感染性。根据转录组测序分析发现，在病毒复制过程中N、E、7a亚基因表达量较高。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种针对新型冠状病毒N亚基因引物、探针组合及检测试剂盒，实现对新型冠状病毒亚基因的快速检测，从而为判断新型冠状病毒的感染性提供参考。
[0007]本专利技术针对新型冠状病毒亚基因检测需求，提供一种检测新型冠状病毒N亚基因的荧光定量PCR引物、探针组合物，同时提供内标基因RNaseP的荧光定量PCR引物、探针组合物以质控核酸抽提及PCR反应过程，消除假阴性的产生，使整个检测过程实验准确可靠。本专利技术还提供了包含上述组合物的新型冠状病毒N亚基因荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。具体技术方案如下：
[0008]本专利技术第一方面提供了一种设计用于检测活性新型冠状病毒的组合物的方法，所述的方法包括：设计靶向Leader区和/或N基因区的探针。
[0009]作为一种实施方案，所述的探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列。
[0010]作为一种优选的实施方案，所述的探针5
’
端以FAM荧光基团标记。
[0011]作为一种优选的实施方案，所述的探针3
’
端以BHQ1荧光基团标记。
[0012]作为一种实施方案，所述的方法还包括：设计靶向Leader区的上游引物。
[0013]作为一种优选的实施方案，所述的上游引物包括如SEQ ID NO.7所示的序列。
[0014]作为一种更为优选的实施方案，所述的上游引物还包括在如SEQ ID NO.7所示序列的第四位引入突变的序列。在本专利技术的具体实施例中，所述的突变为将A突变为G，突变后的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]作为一种实施方案，所述的方法还包括：设计靶向N基因区的下游引物。
[0016]作为一种优选的实施方案，所述的下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列。
[0017]本专利技术第二方面提供了一种用于检测活性新型冠状病毒的组合物，所述的组合物包括采用本专利技术第一方面所述的方法设计的探针。
[0018]作为一种优选的实施方案，所述的探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列。
[0019]作为一种更为优选的实施方案，所述的探针5
’
端以FAM荧光基团标记。
[0020]作为一种更为优选的实施方案，所述的探针3
’
端以BHQ1荧光基团标记。
[0021]作为一种实施方案，所述的组合物还包括采用本专利技术第一方面所述的方法设计的上游引物。
[0022]作为一种优选的实施方案，所述的上游引物包括如SEQ ID NO.7所示的序列。
[0023]作为一种更为优选的实施方案，所述的上游引物还包括在如SEQ ID NO.7所示序列的第四位引入突变的序列，在本专利技术的具体实施例中，所述的突变为将A突变为G，突变后的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0024]作为一种实施方案，所述的组合物还包括采用本专利技术第一方面所述的方法设计的下游引物。
[0025]作为一种优选的实施方案，所述的下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列。
[0026]本专利技术第三方面提供了一种诊断新型冠状病毒的试剂盒，所述的试剂盒包含本专利技术第二方面所述的组合物。
[0027]作为一种实施方案，所述的试剂盒包含至少一种反应混合物，其中所述至少一种反应混合物包含以下一种或多种：DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、阳性对照核酸、阴性对照核酸、对照引物、对照探针、内标核酸、内标核酸引物、内标核酸探针、KCl、MgCl2、乙酸钾、缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、二甲基亚砜、甜菜碱、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、非离子型去污剂、铵离子、乙二胺四乙酸。
[0028]作为一种优选的实施方案，所述的阳性对照核酸为包含新型冠状病毒N亚基因片段的重组质粒。
[0029]作为一种更为优选的实施方案，所述的重组质粒的载体为pMD19
‑
T。
[0030]作为一种更为优选的实施方案，所述的新型冠状病毒N亚基因片段包括如SEQ ID NO.11所示的序列。
[0031]作为一种优选的实施方案，所述的内标核酸为RNaseP。
[0032]作为一种更为优选的实施方案，所述的RNaseP的上游引物包括如SEQ ID NO.4所示的序列。
[0033]作为一种更为优选的实施方案，所述的RNaseP的下游引物包括如SEQ ID NO.5所示的序列。
[0034]作为一种更为优选的实施方案，所述的RNaseP的探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列。
[0035]作为一种更为优选的实施方案，所述的RNaseP的探针的5
’
端以HEX荧光基团标记。
[0036]作为一种更为优选的实施方案，所述的RNaseP的探针的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种设计用于检测活性新型冠状病毒的组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括：设计靶向Leader区和/或N基因区的探针。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列，优选的，所述的探针5
’
端以FAM荧光基团标记，优选的，所述的探针3
’
端以BHQ1荧光基团标记。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：设计靶向Leader区的上游引物，优选的，所述的上游引物包括如SEQ ID NO.7所示的序列。优选的，所述的上游引物还包括在如SEQ ID NO.7所示序列的第四位引入突变的序列，优选的，所述的突变为将A突变为G，突变后的序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：设计靶向N基因区的下游引物，优选的，所述的下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列。5.一种用于检测活性新型冠状病毒的组合物，其特征在于，所述的组合物包括采用权利要求1或2所述的方法设计的探针，优选的，所述的探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列，优选的，所述的探针5
’
端以FAM荧光基团标记，优选的，所述的探针3
’
端以BHQ1荧光基团标记。6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还包括采用权利要求3所述的方法设计的上游引物，优选的，所述的上游引物包括如SEQ ID NO.7所示的序列，优选的，所述的上游引物还包括在如SEQ ID NO.7所示序列的第四位引入突变的序列，优选的，所述的突变为将A突变为G，突变后的序列如SEQ ID NO.1所示，优选的，所述的组合物还包括采用权利要求4所述的方法设计的下游引物，优选的，所述的下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列。7.一种诊断新型冠状病毒的试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔仑标，朱小娟，葛以跃，乔乔，吴涛，吴斌，赵康辰，朱立国，朱凤才，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心江苏省公共卫生研究院，
类型：发明
国别省市：