本发明专利技术公开一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR引物探针组、试剂盒及检测方法，涉及病毒检测技术领域。本发明专利技术提供一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR引物探针组，包括针对非洲猪瘟病毒B646L基因的检测用引物和探针及针对猪RNA polymerase II基因的检测用引物和探针。本发明专利技术还提供了用于检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法。本发明专利技术试剂盒采用荧光PCR技术，通过荧光报告基团标记的TaqMan探针，实现对非洲猪瘟病毒的定量检测；另外，反应体系中还包含检测猪RNA polymerase II基因保守区的引物和不同荧光报告基团标记的荧光探针作为内部质控用于监控样品的采集是否规范、核酸的提取及PCR扩增是否成功。否成功。否成功。
【技术实现步骤摘要】
一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR引物探针组、试剂盒及检测方法
[0001]本专利技术涉及病毒检测
，更具体地，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR引物探针组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
[0002]非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟于1921年发现于肯尼亚，20世纪50年代从非洲传播至欧洲，20世纪90年代在欧洲被消除后，2007年再次从东非传播到东欧国家格鲁吉亚，此后该病在东欧广泛传播，并于2017年传到俄罗斯伊尔库斯克地区。目前，全球有50多个国家存在ASF散发或暴发。我国是全球养猪和猪肉消费第一大国，养殖密度高，养殖量大，生猪年存栏量占世界猪存栏总量的50％，非洲猪瘟防控的成败直接关系到生猪产业的健康发展、肉品市场供应和经济社会稳定。当前，非洲猪瘟诊断已不仅仅局限于专业实验室，疫病检测已下沉至基层养殖场，然而基层采样人员、检测人员素质参差不齐，空采、漏采、污染现象时有发生，因此传统的单因子检测已不能满足临床需要，必须建立一整套科学合理的质控体系以监控样品的采集是否规范、核酸的提取及PCR扩增是否成功，从而最大限度提高检测的准确性。
技术实现思路
[0003]基于上述问题，本专利技术的第一个目的在于以猪RNA polymerase II作为猪源内部质控靶基因，提供一组携带内控的非洲猪瘟病毒法双重实时荧光定量PCR检测引物和探针。
[0004]本专利技术的第二个目的在于提供一种应用上述技术的检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR试剂盒。该检测试剂盒具有敏度高，特异性强，内源性质控作为整个检测过程的内参质控，监测样品的采集、保存、提取和扩增过程，同时可排除假阴性结果。
[0005]本专利技术的第三个目的在于提供一种利用本专利技术的实时荧光定量PCR试剂盒检测非洲猪瘟病毒的方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0007]本专利技术提供一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR引物探针组，包括以下引物和与引物配合使用的荧光探针：
[0008]针对非洲猪瘟病毒B646L基因：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，且荧光探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记荧光淬灭基团；
[0009]针对猪RNA polymerase II基因：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，且荧光探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记荧光淬灭基团；
[0010]其中，针对非洲猪瘟病毒B646L基因的荧光探针的5
’
端标记的荧光报告基团与针对 RNA polymerase II基因的5
’
端标记的荧光报告基团不同。
[0011]可选的，针对非洲猪瘟病毒B646L基因，荧光探针的5
’
端标记的荧光报告基团为 FAM；3
’
端标记的荧光淬灭基团为ELICPSE；针对猪RNA polymerase II基因，荧光探针的5
’
端标记的荧光报告基团为HEX；3
’
端标记的荧光淬灭基团为BHQ。
[0012]根据本专利技术的第二个目的，本专利技术还提供一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR 试剂盒，所述试剂盒包括上述的实时荧光定量PCR引物探针组。
[0013]进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0014]根据本专利技术的具体实施方式，所述阳性对照包括含非洲猪瘟病毒B646L基因的重组质粒DNA和猪PK
‑
15细胞基因组DNA。例如，所述含非洲猪瘟病毒B646L基因的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0015]所述阴性对照为PCR级水。
[0016]进一步地，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、ROX参比染料和硫柳汞钠。
[0017]根据本专利技术的第三个目的，本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒的检测方法，该方法包括：
[0018]提取待测样品的DNA；
[0019]配制实时荧光定量PCR反应体系，所述反应体系包括上述实时荧光定量PCR引物探针组；
[0020]进行荧光PCR扩增反应；
[0021]结果判定。
[0022]可选的，所述实时荧光定量PCR反应体系包括：0.02U/μL Taq DNA聚合酶、0.2mMdNTP、1
×
PCR缓冲液，检测非洲猪瘟病毒ASFV B646L基因的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪RNA polymerase II基因的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，0.5
×
ROX参比染料，0.005％硫柳汞钠。
[0023]可选的，所述荧光PCR扩增反应的条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃延伸34秒,共进行45个循环，设置60℃采集荧光信号。
[0024]本专利技术的有益效果如下：
[0025]本专利技术试剂盒采用荧光PCR技术，通过荧光报告基团标记的TaqMan探针，实现对非洲猪瘟病毒(ASFV)的定量检测；另外，反应体系中还包含检测猪RNA polymerase II基因保守区的引物和不同荧光报告基团标记的荧光探针作为内部质控用于监控样品的采集是否规范、核酸的提取及PCR扩增是否成功，因而能有效降低假阴性结果的可能性。
附图说明
[0026]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0027]图1示出动力学扩增曲线。
[0028]图2示出B646L靶标标准曲线。
[0029]图3示出PRP内控标准曲线。
[0030]图4示出本专利技术试剂盒的灵敏度结果。
[0031]图5示出进口试剂盒A的灵敏度结果。
[0032]图6示出进口试剂盒B的灵敏度结果。
[0033]图7示出进口试剂盒C的灵敏度结果。
[0034]图8示出本试剂盒内部质控灵敏度结果。
具体实施方式
[0035]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0036]实施例1引物和探针的设计与筛选
[0037]根据GeneBank公布的ASFV B646L基因序列以及猪RNA polymerase II(PRP II)基因序列，通过序列比对，在基因保守区分别设计多套引物及探针，经优化实验，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR引物探针组，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的荧光探针：针对非洲猪瘟病毒B646L基因：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，且荧光探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记荧光淬灭基团；针对猪RNA polymerase II基因：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，且荧光探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记荧光淬灭基团；其中，针对非洲猪瘟病毒B646L基因的荧光探针的5
’
端标记的荧光报告基团与针对RNA polymerase II基因的5
’
端标记的荧光报告基团不同。2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物探针组，其特征在于，针对非洲猪瘟病毒B646L基因，荧光探针的5
’
端标记的荧光报告基团为FAM；3
’
端标记的荧光淬灭基团为ELICPSE；针对猪RNA polymerase II基因，荧光探针的5
’
端标记的荧光报告基团为HEX；3
’
端标记的荧光淬灭基团为BHQ。3.一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR引物探针组。4.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：余斌，袁秀芳，徐丽华，李军星，苏菲，叶十一，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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