一种快速专一检测乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种快速专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒及其使用方法，属于生物技术领域。该试剂盒包括工作标准品、恒温扩增反应液和阴性对照品，工作标准品包括乙型流感病毒特异保守序列的阳性对照质粒，特异保守序列为SEQ ID No.1；恒温扩增反应液中包括6条引物：引物F3，其序列为SEQ ID No.2；引物B3，其序列为SEQ ID No.3；引物FIP，其序列为SEQ ID No.4；引物BIP，其序列为SEQ ID No.5；引物LB，其序列为SEQ ID No.6；引物LF，其序列为SEQ ID No.7；阴性对照品为健康人的鼻咽拭子核酸提取液。本发明专利技术所提供的乙型流感病毒核酸恒温扩增检测试剂盒具有很好的一致性，且准确度高、操作快速、方法简便。方法简便。

【技术实现步骤摘要】
一种快速专一检测乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测
，具体涉及一种快速、专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，病毒颗粒呈球状，直径为80nm
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120nm，为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。流感病毒按照核蛋白和基质蛋白的不同可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。
[0003]由于特异性高和敏感性好，分子诊断技术被广泛用于流感病毒的检测，特别是在临床实验室中。由于病毒RNA在临床样品中是极微量的。因此，在许多分子诊断测定中，病毒核酸的提取、扩增和分析通常是必不可少的，在分子检测过程中，引物的设计对于检测的特异性和灵敏度有重要作用。聚合酶链式反应即PCR技术为分子扩增的一种常用方法，但PCR技术对硬件设备要求很高，仪器通常比较昂贵，且扩增速度慢，因此环介导的恒温扩增技术(loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)应运而生。环介导的恒温扩增技术是一种新的核酸扩增技术，它具有快速简单以及特异性强的特点，能够有望替代传统PCR方法对微生物的检测。因此，我们针对乙型流感病毒核酸的一段特异基因序列，专利技术了一种试剂盒，它能够快速特异的检测乙型流感病毒。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种快速专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒及其使用方法，其能够实时的对患者鼻咽拭子等样本中的乙型流感病毒进行快速精准检测。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种快速专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒，其包括工作标准品、恒温扩增反应液和阴性对照品，
[0006]所述工作标准品包括乙型流感病毒的特异保守序列的阳性对照质粒，所述特异保守序列为SEQ ID No.1；
[0007]所述恒温扩增反应液中包括6条引物：引物F3，其序列为SEQ ID No.2；引物B3，其序列为SEQ ID No.3；引物FIP，其序列为SEQ ID No.4；引物BIP，其序列为SEQ ID No.5；引物LB，其序列为SEQ ID No.6；引物LF，其序列为SEQ ID No.7；
[0008]所述阴性对照品为健康人的鼻咽拭子核酸提取液。
[0009]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以有如下更进一步的具体选择。
[0010]具体的，所述阳性对照质粒由乙型流感病毒基因特异保守序列对应的合成片段克隆至pGEM
‑
T载体中构建而成，其浓度为104copies/μL。
[0011]具体的，所述恒温扩增反应液的溶剂为双蒸水，所述恒温扩增反应液含有如下浓度的各溶质：8U/20μL Bst DNA聚合酶；8mM MgSO4；2.4mM each dNTPs；20mM KCl；20mM
(NH4)2SO4；40Mm Tris
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HCl；0.2wt％TritonX
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100；5pmol引物F3；5pmol引物B3；40pmol引物FIP；40pmol引物BIP；20pmol引物LB；20pmol引物LB；1.25
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EvaGreen荧光染料。
[0012]此外，本专利技术还提供了一种使用上述的快速专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒的方法，其包括如下步骤：
[0013]S1.待测鼻咽拭子样本总核酸制作；
[0014]S2.取三支反应管，每个反应管均加入20μL所述恒温扩增反应液，然后在第一反应管中加入5μL待测样本、在第二反应管中加入5μL工作标准品、在第三反应管中加入5μL阴性对照品，然后将三个反应管置于恒温条件下进行扩增反应；
[0015]S3.扩增反应过程中实时测定荧光值，反应结束后根据扩增曲线以确定待测样本中是否含有乙型流感病毒。
[0016]具体的，扩增反应的反应温度为65℃，反应时间为30min。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0018]本专利技术通过对乙型流感病毒基因序列进行比对分析筛选出了一段包含700bp的特异保守序列，然后针对以上特异保守序列设计了6条特异引物，该6条特异引物与Bst DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料(通过肉眼观察浊度会为检测带来误差，检测的灵敏度也不高，故添加了荧光染料)、必要的无机盐及缓冲液构成了恒温扩增反应液，乙型流感病毒的核酸在上述恒温扩增反应液中可快速扩增，通过荧光实时监测，从而实现对乙型流感病毒的快速检测，可应用于痰液或鼻咽拭子样本中乙型流感病毒的快速检测，操作方便、检测便捷；以上述恒温扩增反应液、含有乙型流感病毒特异保守序列的工作标准品及阴性对照品构成了快速专一检测乙型流感病毒的试剂盒，使用时以待测样品总核酸、工作标准品及阴性对照品各5μL，分别加入装有20μL所述恒温扩增反应液的三个反应管中，扩增反应过程中，对实时监测到的荧光值进行比对，即可快速完成检测。
[0019]本专利技术提供的试剂盒的灵敏度及特异性均非常好：与荧光检测设备配合，其最低检测出限为1000copies/mL，对常见呼吸道致病菌包括甲型流感病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌等提取核酸后进行检测，特异性测试实验中只有乙型流感病毒有扩增曲线，其它常见致病微生物均无扩增曲线。本专利技术试剂盒因快速、高敏、操作简单、成本低等优点，适合快速检测、现场检测和基层医疗机构推广应用。
附图说明
[0020]图1为针对本专利技术提供的试剂盒进行的特异性试验的扩增曲线；
[0021]图2为针对本专利技术提供的试剂盒进行的灵敏度试验的结果；
[0022]图3为针对本专利技术提供的试剂盒进行的临床样品实验的扩增曲线。
具体实施方式
[0023]以下结合附图及具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0024]一种快速专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒，其包括工作标准品、恒温扩增反应液和阴性对照品，所述工作标准品包括乙型流感病毒的特异保守基因序列的阳性对照质
粒，所述特异保守序列为SEQ ID No.1；所述恒温扩增反应液中包括6条引物：引物F3，其序列为SEQ ID No.2；引物B3，其序列为SEQ ID No.3；引物FIP，其序列为SEQ ID No.4；引物BIP，其序列为SEQ ID No.5；引物LB，其序列为SEQ ID No.6；引物LF，其序列为SEQ ID No.7；所述阴性对照品为健康人的鼻咽拭子核酸提取液。
[0025]1.工作标准品的配制方法具体如下：
[0026](1)用化学合成法合成一段700bp长度的乙型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速、专一的检测乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括工作标准品、恒温扩增反应液和阴性对照品。所述工作标准品为包括乙型流感病毒基因特异保守序列的阳性对照质粒，所述特异保守序列为SEQ ID No.1；所述恒温扩增反应液中包括6条引物：引物F3，其序列为SEQ ID No.2；引物B3，其序列为SEQ ID No.3；引物FIP，其序列为SEQ ID No.4；引物BIP，其序列为SEQ ID No.5；引物LB，其序列为SEQ ID No.6；引物LF，其序列为SEQ ID No.7；所述阴性对照品为健康人的鼻咽拭子核酸提取液。2.根据权利要求1所述的一种快速、专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒由特异保守序列对应的合成片段克隆至pGEM
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T载体中构建而成，其浓度为104copies/μL。3.根据权利要求1所述的一种快速、专一检测乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增反应液的溶剂为双蒸水，所述恒温扩增反应液含有如下浓度的各溶质：8U/20μL Bst DNA聚合酶；8mM MgSO4；2.4mM each dNTPs；20mM KCl；20mM(NH4)2SO4；40Mm Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘清梅，白洁，齐希峰，
申请(专利权)人：弗罗朗浙江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：