一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用制造技术

一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用，属于病原检测技术领域。为了解决利用普通PCR方法检测水貂星状病毒灵敏度、特异性和速度不够的问题，本发明专利技术设计得到了基于qPCR的引物探针组，利用该引物探针组检测水貂星状病毒能够提高检测的灵敏性、特异性和检测速度，具有重复性和稳定性良好的特点。本发明专利技术获得的基于qPCR的引物探针组及包含该引物探针组的试剂盒可应用于水貂星状病毒的检测，对水貂星状病毒检测技术的改进具有重要意义。对水貂星状病毒检测技术的改进具有重要意义。对水貂星状病毒检测技术的改进具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用


[0001]本专利技术属于病原检测
，具体涉及一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用。

技术介绍

[0002]2014年，我国首次发现，因感染水貂星状病毒而出现脑炎症状(水貂震颤综合征)的水貂，该病毒的感染具有窝发传染性，这给水貂养殖业带来极大的危害。星状病毒是星状病毒科的一种无包膜、单链RNA病毒，有较高的遗传多样性和重组潜能，由于在复制过程中其聚合酶没有校对功能，进而复制极易突变，因此该病毒的检测较为困难。
[0003]目前，水貂星状病毒的临床检测主要为普通PCR方法，国内尚未有该病毒实时荧光定量检测方法的相关专利，而实时荧光定量PCR检测技术是在普通PCR技术的基础上发展起来一种灵敏度高、特异性强、速度快的检测技术，对各类病原的检测具有更好的效果，因此，亟需一种用于检测水稻星状病毒的实时荧光定量PCR检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术为解决利用普通PCR方法检测水貂星状病毒灵敏度、特异性和速度不够的问题，提供一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用，具体技术方案如下：
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组，所述引物探针组由上游引物、下游引物和探针组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述探针5
’
端标记有报告基团，3
’
端标记有荧光淬火基团。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述报告基因为6
‑
羧基荧光素，所述荧光淬火基团为TAMR
‑
N。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供上述引物探针组在制备用于检测水貂星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种基于qPCR检测水貂星状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述的上游引物、如SEQ ID No.3示的下游引物和如SEQ ID No.4所示的探针。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，利用所述试剂盒扩增目的基因的反应体系为：2
×
荧光定量PCR预混液10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，探针0.2μL，DNA2μL，去离子水7.0μL。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μM。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，利用所述试剂盒扩增目的基因的反应条件为95℃30s；95℃5s，60℃1min，40个循环。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]本专利技术通过对不同宿主来源的星状病毒ORFla基因的核苷酸序列进行比对，选取ORFla基因的相对保守区，根据水貂星状病毒ORFla基因，设计了基于实时荧光定量PCR的引物探针组。将该引物探针组应用于水貂星状病毒的检测中，并通过对荧光定量PCR反应体系和条件的优化，获得了最低检测量为6.274
×
104copies/μL的灵敏性、特异性、准确性、重复性和稳定性良好且快速的水貂星状病毒检测方法。
附图说明
[0015]图1为星状病毒的qPCR标准曲线；
[0016]图2为荧光定量PCR方法的灵敏性检测结果图；图中扩增曲线水貂星状病毒从左至右的浓度依次为6.274
×
10
10
copies/μL，6.274
×
109copies/μL，6.274
×
108copies/μL，6.274
×
107copies/μL，6.274
×
106copies/μL，6.274
×
105copies/μL，6.274
×
104copies/μL，6.274
×
103copies/μL；
[0017]图3为荧光定量PCR方法的特异性检测结果图；图中扩增曲线从左至右依次为水貂星状病毒(6.274
×
105copies/μL)、水貂星状病毒(6.274
×
104copies/μL)，犬瘟热病毒，犬细小病毒，水貂细小病毒。
具体实施方式
[0018]以下结合具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0019]本专利技术所用到的仪器为由Roche公司生产的LightCycler 96荧光PCR仪
[0020]本专利技术所用的病毒RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、PCR预混液购自Takara公司，引物探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0021]实施例1：一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组
[0022]引物和探针的设计：
[0023]星状病毒基因组大小6.8kb，包含3个开放阅读框，编码非结构蛋白ORFla，ORFlb和编码衣壳蛋白ORF2，其中编码非结构蛋白ORFla的基因大小为2.8kb以内，编码110kDa的氨基酸，多肽包含多种保守基因序列，组成病毒的丝氨酸蛋白酶，编码病毒的非结构蛋白。对不同宿主来源的星状病毒(如人、猪和牛等)ORFla基因的核苷酸序列比对，选取ORFla基因的相对保守区，在Astv的序列保守区设计引物和探针，参考序列的NCBI登录号为NC_004579。
[0024]上游引物序列如SEQ ID No.1所示：5
’‑
GCTTGAGGTCTTAGCCAG
‑3’
或如SEQ ID No.2所示：5
’‑
GCTTGAGGTCTTAGCTAG
‑3’
；
[0025]下游引物序列如SEQ ID No.3所示：5
’‑
TCCCTCCAAAGTTTATC
‑3’
；
[0026]探针序列如SEQ ID No.4所示：5
’
FAM
‑
CAGTCGCTCCGTGACATGGAC
‑3’
TAMR
‑
N。
[0027]利用上述引物探针组扩增出的序列如SEQ ID No.5所示：
[0028]5’‑
CTTGAGGTCTTAGCCAGGCACATCCGCAACTTGGGCGGCGAGGAGCCCGTCCATGTCACGGAGCGACTGCTTGATAAACTTTGGAGGGGA
‑3’
[0029]实施例2：基于荧光定量PCR的检测水貂星状病毒的方法<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组由上游引物、下游引物和探针组成；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针5
’
端标记有报告基团，3
’
端标记有荧光淬火基团。3.根据权利要2所述的引物探针组，其特征在于，所述报告基因为6
‑
羧基荧光素，所述荧光淬火基团为TAMR
‑
N。4.权利要求1
‑
3任意一项所述的引物探针组在制备用于检测水貂星状病毒的试剂或试...

【专利技术属性】
技术研发人员：白雪，鲁荣光，李虹晔，胡博，李甜甜，张海玲，廉士珍，李双双，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：