高亲合力WT1T细胞受体及其用途制造技术

本公开提供了对来自Wilms肿瘤蛋白1(WT1)的肿瘤相关抗原p37具有高功能亲合力的T细胞受体(TCR)和相关结合蛋白、表达这种高亲和力的WT1特异性TCR的T细胞、其编码核酸以及用于治疗细胞过度表达WT1和/或产生p37抗原的疾病或病症的组合物，例如在癌症中。例如在癌症中。例如在癌症中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高亲合力WT1 T细胞受体及其用途
[0001]关于序列表的声明
[0002]与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本名称是360056_466WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件是243KB，创建于2020年3月8日，正在通过EFS
‑
Web以电子方式提交。

技术介绍

[0003]使用基因工程T细胞的过继性T细胞免疫疗法在多项试验中显示出前景，其中使用具有足够亲和力的抗原受体靶向肿瘤相关抗原，包括基于抗体的嵌合受体1‑3和高亲和力TCR4‑8。虽然胸腺中多样性产生的自然过程采用RAG介导的TCR基因重排来产生长度和氨基酸组成不同的高度多样化的CDR3，但在中枢耐受施加的亲和力限制内分离有效的高亲和力TCR，仍然是对已确定候选细胞内自身/肿瘤抗原的多种恶性肿瘤实施过继性T细胞免疫疗法的实质性障碍
9,10
。此外，TCR过继免疫疗法具有检测由MHC I类呈递在细胞表面的细胞内抗原的能力。
[0004]由于WT1蛋白的免疫特性(Cheever et al.,Clin.Cancer Res.15:5323,2009)及其在许多与不良预后相关的侵袭性肿瘤类型中的表达，WT1蛋白是临床开发的一个有吸引力的目标。WT1涉及促进增殖和致癌性的基因表达的调节(Oji et al.,Jpn.J.Cancer Res.90:194,1999)，在大多数高危白血病(Menssen et al.,Leukemia 9:1060,1995)、高达80％NSCLC(Oji et al.,Int.J.Cancer 100:297,2002)、100％间皮瘤(Tsuta et al.,App.Immunohistochem.Mol.Morphol.17:126,2009)和≥80％妇科恶性肿瘤(Coosemans and Van Gool,Expert Rev.Clin.Immunol.10:705,2014)中过度表达。已知WT1蛋白的几种肽是肿瘤相关抗原肽，是HLA
‑
A*0201限制性抗原。
[0005]显然需要针对各种癌症(例如白血病和肿瘤)的替代性高WT1抗原特异性TCR免疫疗法。当前公开的实施例解决了这些需要并提供了其他相关优点。
附图说明
[0006]图1A和1B示出了如何通过基于高通量测序的策略识别WT1
37
特异性TCR。(A)用于识别与高WT1
37
‑
45
肽/MHC四聚体结合相关的TCR克隆型的基于初始测序的策略示意图。(B)示出了分选群体与总群体的百分比的富集关系，并突出了选定的TCR。由黑色圆圈表示的所有TCR均已合成并评估其抗原特异性(共27个)。
[0007]图2示出了结合高水平CD8非依赖性(CD8i)四聚体的TCR的功能性评估的结果。在缺乏内源性TCRα/β链的Jurkat细胞内表达TCR构建体。示出了每个TCR的四聚体染色与CD3表达的关系(CD3表达与转基因TCR表面表达直接相关)。
[0008]图3A
‑
3C示出了额外的WT1
37
特异性TCR是通过改进的基于高通量测序的策略使用CD8非依赖性(CD8i)四聚体进行识别。(A)用于识别与高CD8非依赖性WT1
37
肽/MHC四聚体结合相关的TCR克隆型的基于改进测序的策略示意图。(B)与(C)的类似分析相比，当使用CD8i四聚体时，显示了原始分选群体与总群体百分比的富集。根据降低的表面CD3水平和CD8i四
聚体结合，选择了额外的14个TCR。由阴影(对角线图案)圆圈表示的所有TCR均已合成并评估其抗原特异性。
[0009]图4示出了选定的WT1
37
TCR的CD8i四聚体结合。在缺乏内源性TCRα/β链的Jurkat细胞内表达TCR构建体。示出了四聚体染色与每个TCR的CD3表达的关系(CD3表达与转基因TCR表面表达直接相关)。
[0010]图5A和5B示出了在转导进原代CD8
+
PBMC时，在IFNγ测定中选定的TCR的肽EC
50
的计算。(A)将选定的TCR转导进从供体PMBC分离的CD8
+
T细胞。在一周后，将细胞分选为四聚体
+
CD8
+
细胞并扩增。将扩增的抗原特异性细胞与肽脉冲T2靶细胞一起培养4至6小时，并通过流式细胞术确定IFNγ的产生。(B)通过非线性回归将产生IFNγ的细胞的百分比拟合到剂量
‑
反应曲线以计算每个TCR的肽EC
50
。
[0011]图6示出了表达WT1
37
‑
特异性TCR的原代CD8
+
T细胞有效地杀死WT1
+
HLA
‑
A2
+
乳腺癌细胞系MDA
‑
MB
‑
468。针对高四聚体结合进行分选纯化，将CD8
+
初级T细胞用TCR转导，并以8:1的比例(一式三份)与已用Rapid Red染料染色的乳腺癌细胞系MDA
‑
MB
‑
468混合。在72小时内每个TCR转导T细胞群体指定的时间点计算红色物体总面积(与活的靶细胞的总数量相关)。为了评估TCR转导T细胞对持久性抗原的持续反应性，在48小时添加额外的MDA
‑
MV
‑
468细胞。
[0012]图7示出了表达TCR10.1的CD4
+
和CD8
+
T细胞都可在体外反复攻击后消灭WT1
+
A2
+
胰腺癌细胞系PANC
‑
1。将CD4
+
和CD8
+
T细胞都转导以表达WT1
37
TCR10.1。将CD4
+
T细胞进一步转导以表达CD8α和CD8β基因。在8天后，将转导的细胞分选以纯化CD8
+
四聚体
+
和CD4
+
/CD8
+
四聚体
+
T细胞。CD4+/CD8+、CD8+或这两个群体(CD4和CD8)的抗原特异性细胞混合物以8:1(一式三份)的比例与先前已转导以表达Red染料的胰腺癌细胞系PANC
‑
1混合。在每个TCR转导T细胞种群指定的时间点计算红色物体总面积(与活的靶细胞的总数量有关)。为了评估TCR转导T细胞对持久性抗原的持续反应性，在48小时添加额外的PANC
‑
1细胞。
[0013]图8A
‑
8D示出了与使用本公开的WT1 p37肽特异性TCR转导的T细胞杀死(WT1
37
‑
45 TCR15.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.T细胞受体(TCR)，包括：(a)TCRα链可变(V
α
)结构域，以及具有SEQ ID NO：199、1
‑
11、181、187、193、205、211、217、223、229、235和241中任何一个所列CDR3氨基酸序列的TCRβ链可变(V
β
)结构域；(b)具有SEQ ID NO：196、12
‑
22、178、184、190、202、208、214、220、226、232和238中任何一个所列CDR3氨基酸序列的TCR V
α
结构域和TCR V
β
结构域；或(c)具有SEQ ID NO：199、1
‑
11、181、187、193、205、211、217、223、229、235和241中任何一个所列出的CDR3氨基酸序列的TCR V
α
结构域，以及包括SEQ ID NO：196、12
‑
22、178、184、190、202、208、214、220、226、232和238中任何一个所列出的CDR3氨基酸序列的TCR V
β
结构域；其中，TCR特异性地与VLDFAPPGA(SEQ ID NO：59)：人类白细胞抗原(HLA)复合物结合，IFNγ产生pEC
50
为8.5或更高。2.根据权利要求1所述的TCR，其中所述TCR特异性地与VLDFAPPGA(SEQ ID NO：59):人类白细胞抗原(HLA)复合物结合，IFNγ产生pEC
50
为9.0或更高。3.根据权利要求1或2所述的TCR，其中所述TCR特异性地与VLDFAPPGA(SEQ ID NO：59)：人类白细胞抗原(HLA)复合物结合，其IFNγ产生pEC
50
为9.5或更高。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的TCR，其中所述TCR进一步特异性地与细胞表面的VLDFAPPGA(SEQ ID NO：59)：人类白细胞抗原(HLA)复合物结合，所述复合物独立于CD8或在没有CD8时。5.权利要求1
‑
4中任一项所述的TCR，其中所述HLA包括HLA
‑
A*201。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的TCR，其中V
α
结构域包括氨基酸序列，所述序列至少具有：(a)与SEQ ID NO：34
‑
35和38
‑
44中的任何一个列出的氨基酸序列有约90％的序列同一性；或(b)与SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列有92％的序列同一性。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的TCR，其中V
α
结构域包括CDR1和/或CDR2的氨基酸序列与分别存在于SEQ ID NO：34
‑
44中任一项的CDR1和/或CDR2相比没有变化。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的TCR，进一步包括：(i)SEQ ID NO：194、176、182、188、200、206、212、218、224、230和236中的任何一个列出的CDR1α氨基酸序列，或其包含一个或两个氨基酸替换的变体，其中，可选的是，所述一个或两个氨基酸替换包含保守的氨基酸替换；和/或(ii)SEQ ID NO：195、177、183、189、201、207、213、219、225、231和237中的任何一个列出的CDR2α氨基酸序列，或其包含一个或两个氨基酸替换的变体，其中，可选的是，所述一个或两个氨基酸替换包含保守的氨基酸替换。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的TCR，其中V
β
结构域包括氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有：(a)与SEQ ID NO：23
‑
25、27、28、30、32和33中的任何一个所列出的氨基酸序列有90％的序列同一性；(b)与SEQ ID NO：29的氨基酸序列有92％的序列同一性；(c)与SEQ ID NO：31的氨基酸序列有93％的序列同一性；或
(d)与SEQ ID NO：26的氨基酸序列有95％的序列同一性。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的TCR，其中V
β
结构域包括CDR1和/或CDR2的氨基酸序列与分别存在于SEQ ID NO：23
‑
33中任一项的CDR1和/或CDR2相比没有变化。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的TCR，进一步包括：(i)SEQ ID NO：197、179、185、191、197、203、209、215、221、227、233和239中的任何一个列出的CDR1β氨基酸序列，或其包含一个或两个氨基酸替换的变体，其中，可选的是，所述一个或两个氨基酸替换包含保守的氨基酸替换；和/或(ii)SEQ ID NO：198、180、186、192、204、210、216、222、228、234和240中的任何一个所列出的CDR2β氨基酸序列，或其包含一个或两个氨基酸替换的变体，其中，可选的是，所述一个或两个氨基酸替换包含保守的氨基酸替换。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的TCR，包括以下列出的CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β和CDR3β氨基酸序列：(i)分别为SEQ ID NO：194、195、196或12、197、198、和199或1；(ii)分别为SEQ ID NO：176、177、178或18、179、180、和181或7；(iii)分别为SEQ ID NO：182、183、184或20、185、186、和187或9；(iv)分别为SEQ ID NO：188、189、190或21、191、192、和193或10；(v)分别为SEQ ID NO：200、201、202或13、203、204、和205或2；(vi)分别为SEQ ID NO：206、207、208或14、209、210、和211或3；(vii)分别为SEQ ID NO：212、213、214或15、215、216、和217或4；(viii)分别为SEQ ID NO：218、219、220或17、221、222、和223或6；(ix)分别为SEQ ID NO：224、225、226或19、227、228、和229或8；(x)分别为SEQ ID NO：230、231、232或22、233、234、和235或11；或(xi)分别为SEQ ID NO：236、237、238或16、238、240、和241或5。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的TCR，其中V
α
结构域包括SEQ ID NO：253
‑
263和34
‑
44中任一项所述的氨基酸序列。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的TCR，其中V
α
结构域由SEQ ID NO：253
‑
263和34
‑
44中任一项列出的氨基酸序列组成。15.根据权利要求1
‑
14中任一项所述的TCR，其中V
β
结构域包括SEQ ID NO：242
‑
252和23
‑
33中任一项所列出的氨基酸序列。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的TCR，其中V
β
结构域由SEQ ID NO：242
‑
252和23
‑
33中任一项列出的氨基酸序列组成。17.根据权利要求1
‑
16中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的TCRα链恒定结构域。18.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括与SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的TCRβ链恒定结构域。19.根据权利要求1
‑
18中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括含有V
α
结构域和α链恒定结构域的TCRα链，其中：(a)V
α
结构域与SEQ ID NO：34
‑
35和38
‑
44中的任何一个列出的氨基酸序列具有至少约90％的序列同一性，并且α链恒定结构域与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少约98％的
序列同一性；或(b)V
α
结构域与SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列具有92％的序列同一性，并且α链恒定结构域与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少约98％的序列同一性。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括含有V
α
结构域和α链恒定结构域的TCRα链，其中：(a)V
α
结构域包括SEQ ID NO：242
‑
252和34
‑
44中任何一个列出的氨基酸序列，而α链恒定结构域包括SEQ ID NO：47的氨基酸序列；或(b)V
α
结构域由SEQ ID NO：242
‑
252和34
‑
44中的任何一个列出的氨基酸序列组成，而α链恒定结构域由SEQ ID NO：47的氨基酸序列组成。21.根据权利要求1
‑
20中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括含有V
β
结构域和β链恒定结构域的TCRβ链，其中：(a)V
β
结构域与SEQ ID NO：23
‑
25、27、28、30、32和33中的任何一个列出的氨基酸序列具有至少约90％的序列同一性，并且β链恒定结构域包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少约95％的序列同一性；(b)V
β
结构域与SEQ ID NO：29的氨基酸序列有92％的序列同一性，并且β链恒定结构域包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46的氨基酸序列有至少约95％的序列同一性；(c)V
β
结构域与SEQ ID NO：31的氨基酸序列有93％的序列同一性，并且β链恒定结构域包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46的氨基酸序列有至少约95％的序列同一性；或(c)V
β
结构域与SEQ ID NO：26的氨基酸序列有95％的序列同一性，并且β链恒定结构域包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46的氨基酸序列有至少约95％的序列同一性。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括含有V
β
结构域和β链恒定结构域的TCRβ链，其中：(a)V
β
结构域包括SEQ ID NO：253
‑
263和23
‑
33中任何一个列出的氨基酸序列，而β链恒定结构域包括SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列；(b)V
β
结构域由SEQ ID NO：253
‑
263和23
‑
33中任何一个列出的氨基酸序列组成，β链恒定结构域由SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列组成；(c)V
β
结构域包括SEQ ID NO：25、28、29、32和33中任何一个列出的氨基酸序列，而β链恒定结构域包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列；(d)V
β
结构域由SEQ ID NO：25、28、29、32和33中任何一个列出的氨基酸序列组成，而β链恒定结构域由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成；(e)V
β
结构域包括SEQ ID NO：23、24、26、27、30和31中任何一个列出的氨基酸序列，而β链恒定结构域包括SEQ ID NO：46的氨基酸序列；或(f)V
β
结构域由SEQ ID NO：23、24、26、27、30和31中任何一个列出的氨基酸序列组成，β链恒定结构域由SEQ ID NO：46的氨基酸序列组成。23.根据权利要求1
‑
22中任一项所述的TCR，其中Vα结构域和Vβ结构域包括或由以下SEQ ID NO中列出的氨基酸序列组成：
(i)分别为253和242；(ii)分别为259和248；(iii)分别为261和250；(iv)分别为262和251；(v)分别为257和246；(vi)分别为254和243；(vii)分别为255和244；(viii)分别为256和245；(ix)分别为258和247；(x)分别为260和249；(xi)分别为263和252；(xii)分别为34和23；(xiii)分别为40和29；(xiv)分别为42和31；(xv)分别为43和32；(xvi)分别为35和24；(xvii)分别为36和25；(xviii)分别为37和26；(xix)分别为39和28；(xx)分别为41和30；(xxi)分别为44和33；或(xxii)分别为38和27。24.根据权利要求23所述的TCR，进一步包括α链恒定结构域和/或β链恒定结构域，其中α链恒定结构域包括与SEQ ID NO：47中所列氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中β链恒定结构域包括与SEQ ID NO：45或46中所列氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。25.根据权利要求24所述的TCR，其中存在α链恒定结构域，Vα结构域和α链恒定结构域共同构成TCRα链。26.根据权利要求24或25所述的TCR，其中存在β链恒定结构域，Vα结构域和β链恒定结构域共同构成TCRβ链。27.根据权利要求1
‑
26中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括scTCR。28.根据权利要求1
‑
26中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括CAR。29.编码根据权利要求1
‑
28中任一项所述的TCR的分离的多核苷酸。30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中编码TCR的多核苷酸对感兴趣的宿主细胞进行了密码子优化。31.根据权利要求29或30所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的氨基酸序列与包括或由其组成的SEQ ID NO：48
‑
58中任何一个所列出的氨基酸序列具有至少95％的同一性。32.根据权利要求29
‑
31中任一项所述的多核苷酸，包括SEQ ID NO.64
‑
165中任一项所
述的多核苷酸序列。33.根据权利要求29
‑
32中任一项所述的多核苷酸，进一步包括：(i)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括CD8共受体α链的细胞外部分，其中，可选地，编码的多肽是或包括CD8共受体α链；(ii)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括CD8共受体β链的细胞外部分，其中，可选的是，编码的多肽是或包括CD8共受体β链；或(iii)(i)的多核苷酸和(ii)的多核苷酸。34.根据权利要求33所述的多核苷酸，包括：(a)编码包括CD8共受体α链细胞外部分的多肽的多核苷酸；(b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括CD8共受体β链的细胞外部分；以及(c)编码自裂解肽的多核苷酸，置于(a)的多核苷酸和(b)的多核苷酸之间。35.根据权利要求33或34所述的多核苷酸，进一步包括编码自裂解肽并被放置在以下的多核苷酸：(1)编码结合蛋白的多核苷酸和编码包含CD8共受体α链细胞外部分的多肽的多核苷酸之间；和/或(2)编码结合蛋白的多核苷酸和编码包括CD8共受体β链细胞外部分的多肽的多核苷酸之间。36.根据权利要求33
‑
35中任一项所述的多核苷酸，包括可操作地连接在框内的以下：(i)(pnCD8α)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnCD8β)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnTCR)；(ii)(pnCD8β)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnCD8α)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnTCR)；(iii)(pnTCR)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnCD8α)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnCD8β)；(iv)(pnTCR)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnCD8β)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnCD8α)；(v)(pnCD8α)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnTCR)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnCD8β)；或(vi)(pnCD8β)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnTCR)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnCD8α)，其中pnCD8α是编码以下多肽的多核苷酸：所述多肽包括CD8共受体α链的细胞外部分，其中pnCD8β是编码以下多肽的多核苷酸：所述多肽包括CD8共受体α链的细胞外部分，其中，pnTCR是编码TCR的多核苷酸，并且其中pnSCP1和pnSCP2各自独立地是编码自裂解肽的多核苷酸，其中多核苷酸和/或编码的自裂解肽可选择相同或不同。37.根据权利要求33
‑
36中任一项所述的多核苷酸，其中编码的TCR包括TCRα链和TCRβ链，其中所述多核苷酸包括编码自裂解肽的多核苷酸，所述多核苷酸放置在编码TCRα链的多核苷酸与编码TCRβ链的多核苷酸之间。38.根据权利要求37所述的多核苷酸，包括可操作地连接在框架内的以下：(i)(pnCD8α)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnCD8β)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnTCRβ)
‑
(pnSCP3)
‑
(pnTCRα)；(ii)(pnCD8β)
‑
(pnSCP1)
‑
(pnCD8α)
‑
(pnSCP2)
‑
(pnTCRβ)
‑
(pnS...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：弗雷德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：