【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高效靶向原位全基因组剖析相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月25日提交的美国临时申请第62/562,918号的权益，所述美国临时申请明确地通过引用整体并入本文。
本公开涉及染色质剖析的方法。具体而言，本公开涉及用于剖析诸如转录因子和核小体的DNA结合蛋白的方法，其中由诸如转座酶或核酸酶的酶进行的抗体靶向控制切割释放结合的DNA用于DNA测序。背景转录因子(transcriptionfactors,TFs)在其结合位点上对DNA的作用驱动基因表达模式，因此全基因组TF作图已经成为个体研究者和大规模基础设施项目的中心目标。TF剖析(TFprofiling)最常用的方法是染色质免疫沉淀(ChIP)，这是一种自30多年前首次引入以来变化不大的方法(Solomon和Varshavsky，1985)。将细胞用甲醛交联，将染色质片段化并溶解，加入抗体，回收抗体结合的染色质用于提取DNA。DNA作图技术的连续进步已彻底改变了X-ChIP(甲醛交联ChIP)的用途，随着ChIP-seq的出现，TF的碱基对分辨率作图变得可行(Rhee和Pugh,2011；Skene和Henikoff,2015；He等，2015)。可通过染色质免疫沉淀分离与转录因子和其他蛋白质直接物理相互作用的特定DNA位点，以产生与体内目标蛋白质结合的靶DNA位点的文库。随着大规模并行测序的出现，可以快速分析文库，并将其作图到全基因组序列数据库，以确定任何蛋白质与DNA的相互作用模式，或任何表观遗传染色质修饰的模式。这可应用于一组可ChIP化...
【技术保护点】
1.一种用于确定细胞中目标染色质相关因子与DNA序列的结合位点的原位方法，所述方法包括:/n将透化细胞与特异性结合所述目标染色质相关因子的第一抗体接触，其中所述第一抗体与多个转座体偶联，所述多个转座体中的每一个包含:/n至少一种转座酶；和/n转座子，其包括:/n含有第一转座酶识别位点的第一DNA分子；和/n含有第二转座酶识别位点的第二DNA分子；/n激活所述转座酶，从而切取与所述目标染色质相关因子结合的DNA的序列，并用所述DNA标签给所述DNA序列加标签，其中所述至少一种转座酶将所述第一和第二DNA分子整合到染色质DNA中，从而切割染色质DNA并用所述第一和第二DNA分子给染色质DNA加标签；/n分离所述切取的DNA；以及/n确定所述切取的DNA的序列，从而对目标染色质相关因子与所述细胞中的一个或多个DNA序列的结合进行作图。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170925 US 62/562,9181.一种用于确定细胞中目标染色质相关因子与DNA序列的结合位点的原位方法，所述方法包括:
将透化细胞与特异性结合所述目标染色质相关因子的第一抗体接触，其中所述第一抗体与多个转座体偶联，所述多个转座体中的每一个包含:
至少一种转座酶；和
转座子，其包括:
含有第一转座酶识别位点的第一DNA分子；和
含有第二转座酶识别位点的第二DNA分子；
激活所述转座酶，从而切取与所述目标染色质相关因子结合的DNA的序列，并用所述DNA标签给所述DNA序列加标签，其中所述至少一种转座酶将所述第一和第二DNA分子整合到染色质DNA中，从而切割染色质DNA并用所述第一和第二DNA分子给染色质DNA加标签；
分离所述切取的DNA；以及
确定所述切取的DNA的序列，从而对目标染色质相关因子与所述细胞中的一个或多个DNA序列的结合进行作图。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体与所述至少一种转座酶间接偶联。
3.权利要求2的方法，其中所述转座酶与特异性结合所述第一抗体的特异性结合剂连接。
4.权利要求1的方法，其还包括:
使所述细胞与特异性结合所述第一抗体的第二抗体接触，并且其中所述转座酶与特异性结合所述第二抗体的特异性结合剂连接。
5.权利要求1的方法，其还包括:
使所述细胞与特异性结合所述第一抗体的第二抗体接触；
使所述细胞与特异性结合所述第二抗体的第三抗体接触，
并且其中所述转座酶与特异性结合所述第三抗体的特异性结合剂连接。
6.权利要求3-5中任一项的方法，其中所述特异性结合剂包括蛋白A或蛋白G或特异性结合所述第一抗体、所述第二抗体和/或所述第三抗体的第三抗体。
7.权利要求1的方法，其中所述目标染色质相关因子与染色质DNA序列的结合是直接的。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述目标染色质相关因子是转录因子。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中将所述细胞固定在固体表面上。
10.权利要求9的方法，其中所述固体表面包含珠粒或微量滴定板的壁。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述第一和/或第二DNA分子还包含条形码。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述第一和/或第二DNA分子还包含测序衔接子。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述第一和/或第二DNA分子还包含通用引发位点。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述至少一种转座酶包括Tn5转座酶。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述至少一种转座酶包括Mu转座酶。
16.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述至少一种转座酶包括IS5或IS91转座酶。
17.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述至少一个转座体包含至少两个不同的转座体，并且其中所述不同的转座体将不同的DNA序列整合到所述染色质DNA中。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其还包括分离所产生的DNA片段。
19.权利要求18的方法，其还包括分析所述分离的核酸片段。
20.权利要求19的方法，其中分析所述分离的核酸片段包括确定所述核苷酸序列。
21.权利要求20的方法，其中所述核苷酸序列是使用测序或杂交技术在扩增或不扩增的情况下确定的。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述细胞是原核细胞。
23.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述细胞是人细胞。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中通过使所述细胞与洋地黄皂苷接触来透化所述细胞和/或所述细胞的细胞核。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其还包括使所述切取的DNA经历盐分级分离。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其还包括确定与目标染色质相关因子相关的一种或多种蛋白质的身份。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述至少一种转座体的一部分包含已知量的污染性DNA，并且其中所述污染性DNA能够用于校准。
29.一种制备切取的染色质DNA的文库的方法，其包括权利要求1-28中任一项的方法。
30.一种检测目标染色质相关因子与细胞中染色质DNA序列的结合的方法，其包括:
将未交联的透化细胞与特异性识别目标染色质相关因子的特异性结合剂接触，其中所述特异性结合剂与处于非活性状态的核酸酶或转座酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·海尼科夫，H·S·卡娅奥库，T·D·布莱森，P·J·斯基恩，
申请(专利权)人：弗雷德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：美国;US
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