一种黄精叶绿体DNA提取优化方法技术

本发明专利技术提供了一种黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于以黄精叶片为材料，用高盐低pH法分离叶绿体，SDS法提取叶绿体基因组DNA（cpDNA），并通过L9（3

【技术实现步骤摘要】
一种黄精叶绿体DNA提取优化方法一、
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种黄精叶绿体DNA提取优化方法。二、
技术介绍
叶绿体是绿色植物进行光合作用的关键场所，具有相对独立的遗传物质-即叶绿体基因组DNA(ChloroplastDNA，cpDNA)。高等植物叶绿体基因组大多数在120-160kb，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。Hans和Walter于1962年证实了叶绿体基因组的存在\。1986年，首次报道了烟草(Nicotianatabacum)、地钱((Marchantiapolymorpha)的叶绿体基因组全序列。近年来，随着高通量测序技术在叶绿体全基因组测序中的广泛应用，叶绿体全序列基因组的数量急剧增加。然而，由于传统的提取方法难以在叶绿体DNA的质量和产量之间取得平衡，高效的cpDNA提取技术成为制约其应用的主要瓶颈。叶绿体基因组因其在基因含量和结构上具有特殊的保守性，为全基因组进化研究提供了充分的信息。许多研究已经证明了其在解决不同分类层次的系统发育关系以及利用叶绿体全基因组序列了解结构和功能进化方面的潜力。目前分离植物叶绿体的方法主要有以下三种：蔗糖密度梯度离心法、Percoll密度梯度离心法和高盐低pH法。现有研究表明，高盐低pH法因其具有操作简单，成本低，产率高等优点而得到广泛应用，目前已成功应用于小麦、松柏、茶树、割手密、尾叶桉、芒果、甘薯等多种植物。黄精中多糖、多酚等次生物质含量较高，影响其cpDNA提取的质量。目前对于黄精cpDNA提取方法还未见报道。本研究通过借鉴其他高等植物cpDNA的提取方法，通过正交试验，初步筛选出适合黄精cpDNA提取的方案，为黄精高质量cpDNA提取和叶绿体基因组功能研究奠定基础。三、
技术实现思路
技术问题为了快速、有效地获得黄精cpDNA，本专利技术采用高盐低pH法，并结合黄精本身的生物学特性进行研究，成功获得了质量好，产率高，无核基因组污染的cpDNA，为黄精属植物高质量cpDNA提取和叶绿体基因组功能研究奠定了基础。技术方案本专利技术所述的黄精叶绿体DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用正交试验优化叶绿体分离：将黄精叶片黑暗处理，用液氮研磨，加入缓冲液A，混匀，过滤，收集滤液，进行第一次离心，取上清；对上清液进行第二次离心，保留沉淀；向沉淀中加入缓冲液B，混匀，进行第三次离心，保留沉淀，重复此步骤，即得纯化的黄精叶绿体。(2)裂解叶绿体：向步骤(1)中的叶绿体加入缓冲液C和蛋白酶K，混匀，37℃温育4-5h。(3)提取叶绿体DNA：将步骤(2)中的裂解混合溶液先用Tris饱和酚抽提，再用氯仿-异戊醇多次抽提；加入异丙醇，于-20℃沉淀DNA；离心，溶解，加入RNase，37℃孵育30min-60min，即得叶绿体DNA。所述步骤(1)中，选取缓冲液中NaCl浓度、叶片用量、去核离心力为考察因素，采用正交试验进行优化，筛选黄精叶绿体分离的最佳条件；其中，缓冲液中NaCl浓度为1.25-1.75mol/L、叶片用量为5-15g、去核离心力为200-600g。所述步骤(1)中黄精叶片的处理方法是：将叶片置于4℃黑暗处理24-48h以消化叶片中的淀粉。所述的过滤方法是：利用6-8层纱布过滤匀浆至预冷的烧杯中。所述步骤(1)中第一次离心温度为4℃，转速为200-600g，时间为8min；第二次离心和第三次离心温度为4℃，转速为2500g，时间为12min。所述缓冲液A的组分及配比如下：1.25-1.75mol/LNaCl，50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，0.25mmol/L抗坏血酸，1.5％PVP，pH＝3.6；所述缓冲液B的组分及配比如下：1.25-1.75mol/LNaCl，50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1mmol/LDTT，0.1％牛血清蛋白BSA，pH＝8.0；所述缓冲液C的组分及配比如下：1.25-1.75mol/LNaCl，50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，2.0％SDS，pH＝8.0。所述黄精叶绿体分离的最佳条件为：缓冲液中NaCl浓度为1.50mmol/L，叶片用量为10g，去核离心力为600g。所述步骤(3)中氯仿-异戊醇的体积比为(23-25)：1；所述离心条件为：4℃下12000g离心10-15min。所述实验操作均在冰上进行，实验所用的试剂、仪器等都需进行预冷处理。有益效果本专利技术通过高盐低pH法可以快速、有效地获得黄精cpDNA，提取的cpDNA电泳条带完整单一，无拖尾现象，无核DNA的污染，可用于基因克隆等后续分子实验。该方法简单易行，成本低，产率高，能够为黄精属植物高质量cpDNA提取和叶绿体基因组结构、功能的研究奠定基础。附图说明图1黄精叶绿体DNA电泳检测。M：DL15000Marker，1-9：各试验号所提取的cpDNA。图2叶绿体基因组特异性引物ITSWF4对cpDNA的扩增结果。M：DL2000Marker，1-9：以各试验号提取的cpDNA为模版得到的扩增产物。图3核基因组特异性引物SX10对cpDNA的扩增结果。M：DL2000Marker，1-9：以各试验号提取的cpDNA为模版得到的扩增产物。其中1、5、9的去核离心力为200g，2、6、7的去核离心力为400g，3、4、8的去核离心力为600g。五、具体实施方法结合具体实例来进一步说明本专利技术，但并不对其内容做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备均为本
常规试剂、方法和设备。1材料与方法1.1供试材料多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua)，采自千岛湖黄精基地。1.2实施例所用缓冲液的组分及配比缓冲液A(pH＝3.6)：1.25-1.75mol/LNaCl，50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，0.25mmol/L抗坏血酸，1.5％(w/v)PVP；缓冲液B(pH＝8.0)：1.25-1.75mol/LNaCl，50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1mmol/LDTT，0.1％(w/v)牛血清蛋白BSA；缓冲液C(pH＝8.0)：1.25-1.75mol/LNaCl，50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，2.0％(w/v)SDS。其中，DTT和牛血清蛋白BSA需现用现加。1.3试验方法1.3.1正交试验设计选择缓冲液中的NaCl浓度、叶片用量及去核离心力为考察因素，进行L9(33)的正交试验，各因素的水平设计如表1。表1正交试验设计表1.3.2黄精叶绿体分离所有实验操作均在冰上进行，实验所用的试剂、仪器等都需进行预冷处理。(1)黄精新鲜叶片用无菌水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)采用正交试验优化黄精叶绿体分离：将黄精叶片黑暗处理，用液氮研磨，加入缓冲液A，混匀，过滤，收集滤液，进行第一次离心，取上清；对上清液进行第二次离心，保留沉淀；向沉淀中加入缓冲液B，混匀，进行第三次离心，保留沉淀，重复此步骤，即得纯化的黄精叶绿体。/n(2)裂解叶绿体：向步骤(1)中的叶绿体加入缓冲液C和蛋白酶K，混匀，37℃温育4-5h。/n(3)提取叶绿体DNA：将步骤(2)中的裂解混合溶液先用Tris饱和酚抽提，再用氯仿-异戊醇多次抽提；加入异丙醇，于-20℃沉淀DNA；离心，溶解，加入RNase，37℃孵育30min-60min，即得叶绿体DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用正交试验优化黄精叶绿体分离：将黄精叶片黑暗处理，用液氮研磨，加入缓冲液A，混匀，过滤，收集滤液，进行第一次离心，取上清；对上清液进行第二次离心，保留沉淀；向沉淀中加入缓冲液B，混匀，进行第三次离心，保留沉淀，重复此步骤，即得纯化的黄精叶绿体。
(2)裂解叶绿体：向步骤(1)中的叶绿体加入缓冲液C和蛋白酶K，混匀，37℃温育4-5h。
(3)提取叶绿体DNA：将步骤(2)中的裂解混合溶液先用Tris饱和酚抽提，再用氯仿-异戊醇多次抽提；加入异丙醇，于-20℃沉淀DNA；离心，溶解，加入RNase，37℃孵育30min-60min，即得叶绿体DNA。


2.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中选取缓冲液中NaCl浓度、叶片用量、去核离心力为考察因素，采用正交试验进行优化，筛选黄精叶绿体分离的最佳条件；其中，缓冲液中NaCl浓度为1.25-1.75mol/L、叶片用量为5-15g、去核离心力为200-600g。


3.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中黄精叶片的处理方法是：将叶片置于4℃黑暗处理24-48h以消化叶片中的淀粉。所述的过滤方法是：利用6-8层纱布过滤匀浆至预冷的烧杯中。


4.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中第一次离心温度为4℃，转速为200-600g，时间为8-12min；第二次离心和...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾巧君，王飞凤，汪得凯，梁宗锁，陈喜良，吴伟茂，丹尼斯曼斯，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33