工程化免疫细胞制造技术

本公开一般涉及免疫学领域。具体而言，本公开涉及表达CAR的免疫细胞，其中，免疫细胞已被修饰使得LCK的表达和/或功能已被降低或消除。本公开还涉及治疗受试者疾病的方法。本公开还涉及治疗受试者疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化免疫细胞


[0001]本公开通常涉及免疫学领域。特别是，本公开涉及表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞和用于治疗受试者疾病的方法。

技术介绍

[0002]免疫疗法最近在治疗癌症患者方面取得了前所未有的突破。在过继性T细胞疗法中，分离的人类T细胞经过基因改造以增强它们对特定肿瘤抗原的特异性，如通过嵌合抗原受体的表达。涉及嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T细胞)的过继性T细胞疗法是免疫肿瘤学管道的主要部分。迄今为止，已经开发出三代CAR
‑
T技术并用于多种癌症的临床试验，包括B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤。
[0003]尽管其作为一种癌症治疗方法非常有用，但采用CAR
‑
T细胞的过继性免疫疗法部分受到细胞表面上内源性T细胞受体表达的限制。表达内源性T细胞受体的CAR
‑
T细胞在施用于同种异体患者后可以识别主要和次要组织相容性抗原。这具有非特异性作用，并可能导致患者发生移植物抗宿主病(GVHD)。
[0004]CAR
‑
T细胞的T细胞过继性免疫疗法的另一个局限性是，在再灌注到患者体内后，由于诸如PD
‑
1、LAG
‑
3、TIGIT等抑制性受体的表达，导致CAR
‑
T细胞开始显示“衰竭”表型，引起T细胞效应器功能丧失。这是实体瘤的一个特殊问题，实体瘤通常表达这些抑制性受体的配体(例如针对PD
‑
1的PD
‑
L1和PD
‑<br/>L2)，并且限制了CAR
‑
T疗法对实体瘤的有用性。
[0005]因此，需要克服或至少减轻上述问题中的一个或多个。

技术实现思路

[0006]本文提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。
[0007]一方面，提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中CAR包含在不存在淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)的情况下起作用的细胞内信号传导结构域或片段，并且其中免疫细胞已被修饰，从而降低或消除了LCK的表达和/或功能。
[0008]在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域或片段在功能失调的LCK存在下是起作用的。
[0009]一方面，提供了表达CAR的免疫细胞，其中，所述免疫细胞已被修饰使得LCK基因的表达或功能已被破坏。
[0010]一方面，提供了一种制造如本文所定义的免疫细胞的方法，该方法包括使免疫细胞与LCK抑制剂在足够的时间和条件下接触以减少或消除LCK的表达和/或功能。
[0011]一方面，提供了一种载体系统，其包含1)包含编码LCK抑制剂的核酸序列的载体和2)包含编码CAR的核酸序列的载体。
[0012]一方面，提供了包含编码LCK抑制剂的核酸序列和编码CAR的核酸序列的载体。
[0013]一方面，提供了一种在细胞疗法中提高表达CAR的免疫细胞的功效的方法，该方法包括使表达CAR的免疫细胞与LCK抑制剂在足够的时间和条件下接触以减少或消除LCK的表
达和/或功能。
[0014]一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括在足够的时间和条件下施用如本文定义的免疫细胞以治疗受试者。
[0015]一方面，提供了用于治疗有需要的受试者的如本文所定义的免疫细胞。
[0016]一方面，提供了本文定义的免疫细胞在制备用于治疗有需要的受试者的药物中的用途。
附图说明
[0017]现在将参考附图仅通过非限制性实例的方式描述本专利技术的某些实施方式，其中：
[0018]图1.人工抗原呈递CHO细胞为CAR和TCR T细胞刺激提供抗原。(A)CAR构建体的示意图。Myc标签用于检测CAR表达。(B)Jurkat 76的慢病毒转导后LMP2A肽(L2)特异性CAR或TCR的表达。CAR构建体使用抗Myc抗体染色，TCR表达由抗CD3抗体鉴定。(C)本研究中使用的三种T细胞系的内源性TCR表达。Jurkat 76细胞系主要用作研究中的主要细胞系。(D)具有共价融合肽序列作为单肽系统的单链HLA构建体的示意图显示在上图中。左下图显示在每个表达特定抗原HLA
‑
A2
‑
L2或无关抗原HLA
‑
A2
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GAG的CHO
‑
APC上使用L2特异性TCR样抗体染色。右下图显示了L2特异性CAR
‑
T对单肽系统中特定肽或无关肽的响应性。数据绘制为来自至少三次实验的技术性三次重复的平均值
±
SD。(E)没有作为多肽系统的共价融合肽序列的单链HLA构建体的示意图显示在上图中。左下图显示了在开槽HLA
‑
A2上脉冲并被相应的特定TCR样Ab染色的不同肽。右下图显示了EBNA1肽(E1)、LMP1肽(L1)或LMP2A肽(L2)特异性CAR
‑
T对多肽系统中脉冲或非脉冲的每个特定肽的响应性。数据代表至少三次独立实验，并绘制为技术性三次重复的平均值
±
SD。(*,p&lt;0.05，无显著性(NS)，P&gt;0.05)
[0019]图2.TCR样CAR的激活不会被CD8增强，而是在没有LCK的情况下转导T细胞信号传导。(A)使用全内反射显微镜(TIRFM)募集CD8。CD8α用mCherry荧光蛋白标记，单链HLA与Clover荧光蛋白共价融合。左图代表成像数据。右图是背景校正平均荧光强度的量化数据。数据绘制为平均值
±
SD，n&gt;80个细胞缀合物(****，p&lt;0.0001)，进行了两次独立实验。(B)在存在或不存在CD8时的CAR
‑
T和TCR
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T的钙通量。曲线由Flowjo的动力学程序模拟。数据代表至少三次独立实验。(C)在存在或不存在CD8辅助受体时的CAR和TCR响应性。在单肽系统中呈递的特定肽L2或GAG的无关肽表位分别标记为CHO
‑
L2或CHO
‑
GAG。数据绘制为来自至少三次独立实验的技术性三次重复的平均值
±
SD(***，p&lt;0.001，无显著性(NS)，p&gt;0.05)。(D)CAR或TCR
‑
Jcam1.6细胞中LCK或FYN表达的蛋白质印迹检测(左图)。LCK缺陷细胞系Jcam1.6(右图)中的CAR或TCR响应性。数据代表至少三次独立实验，并绘制为技术性三次重复的平均值
±
SD。(E)CAR
‑
Jcam细胞的钙通量。曲线由Flowjo的动力学程序模拟。数据代表至少三次独立实验。
[0020]图3.LCK非依赖性CAR信号传导需要CD28共刺激结构域。(A)具有抗CD19scFv的细胞外识别域的CAR构建体的示意图。该构建体的响应性显示在右侧。(B)CD3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中，所述CAR包含在不存在淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)的情况下起作用的细胞内信号传导结构域或片段，并且其中，所述免疫细胞已被修饰，使得LCK的表达和/或功能已被降低或消除。2.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述细胞内信号传导结构域包含在不存在LCK的情况下起作用的CD28蛋白的信号传导结构域或片段。3.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。4.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞包含LCK抑制剂或已与LCK抑制剂接触。5.如权利要求4所述的免疫细胞，其中，LCK抑制剂是能够下调或消除LCK的基因表达或改变LCK功能的核酸序列。6.如权利要求5所述的免疫细胞，其中，能够下调LCK的基因表达的所述核酸选自由反义RNA、antagomir RNA、siRNA、shRNA、CRISPR系统、锌指核酸酶系统和基于转录激活剂样效应子的核酸酶(TALEN)系统组成的组。7.如权利要求4所述的免疫细胞，其中，LCK抑制剂是LCK蛋白的抑制剂。8.如权利要求7所述的免疫细胞，其中，LCK抑制剂选自由氨基喹唑啉、A
‑
420983、A770041、达沙替尼、沙拉替尼和马沙替尼组成的组。9.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞包含载体，所述载体包含编码所述CAR的核酸。10.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞包含载体，所述载体包含编码能够下调或消除LCK的基因表达或改变LCK功能的LCK抑制剂的核酸。11.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞包含载体，所述载体包含编码所述CAR的核酸和编码能够下调或消除LCK的基因表达的LCK抑制剂的核酸。12.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述CAR包含细胞外抗原结合域。13.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述细胞内信号传导结构域还包含初级信号传导结构域，所述初级信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcεRIβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10或DAP12组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域。14.如权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自由DAP10、CD28、CARD11、SLAMF1、LCK1、LCK3、LAT、OX40、CD27、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴凌，N，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：