T细胞抗原受体、其多聚体复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种T细胞抗原受体、表达T细胞抗原受体(TCR)的免疫细胞，及其制备方法和应用。本发明专利技术所述的TCR能够特异性地识别对应的pMHC复合物，激活TCR T细胞，进而产生高水平的细胞因子IFNγ、IL2、TNFα，显著地杀伤靶细胞并延长负荷肿瘤的小鼠的寿命。胞并延长负荷肿瘤的小鼠的寿命。胞并延长负荷肿瘤的小鼠的寿命。

【技术实现步骤摘要】
T细胞抗原受体、其多聚体复合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种抗体或其抗原结合片段、T细胞抗原受体、多聚体复合物，及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是Epstein和Barr于1964年从伯基特氏淋巴瘤(Burkitt
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s lymphoma，BL)的样本中分离的一种γ疱疹病毒，也是第一个被公认的致瘤病毒。EBV原发感染主要发生在人类口咽部的上皮细胞，后因其显著的嗜B淋巴细胞特性，能感染B细胞并在记忆B细胞中长期潜伏存在，导致被感染者终身携带，故而在成人血清中病毒抗体的阳性率超过90％。尽管EBV感染对绝大多数免疫功能正常的人并不会构成太大的威胁，但对于患有先天性或获得性免疫缺陷的人群，EBV会导致多种危及生命的疾病。此外，EBV潜伏感染表达的蛋白(6个核蛋白EBNA1、2、3A、3B和3C，EBNA-LP以及3个潜伏期膜蛋白LMP1、LMP2A、LMP2B)能刺激细胞增生和转化，已被证实与多种恶性肿瘤的发生、发展、临床预后直接相关，包括EBV相关的移植后淋巴细胞增生性疾病(EBV related post-transplant lymphoproliferative diseases，EBV-PTLD)、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin
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s lymphoma，HL)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)、胃癌(Gastric cancer)等。根据潜伏蛋白在这些疾病中的差异表达，将EBV潜伏型分为I、II、III期。目前，靶向EB病毒的抗病毒治疗由于耐药性以及严重副作用等问题，尚不能实现对多种EBV相关疾病的有效控制。
[0003]Papadopounds等最先发现，输注EBV健康携带者的淋巴细胞可以治愈PTLD患者，随后临床发展出自体EBV-CTLs细胞疗法。目前EBV-CTLs已在EBV相关淋巴瘤和鼻咽癌中开展了临床应用，发现其人体内安全性良好并有一定的治疗效果，但体外培养的CTLs的诸多不足也限制了其临床疗效。首先，CTLs中肿瘤相关EBV抗原的特异性T细胞数量较少(＜0.05％)，因此一般需进行大剂量(大于1010)的多次回输(4-6次)；其次，较长的制备周期导致等待治疗时间长，伴随着的T细胞分化亚群的变化进一步导致其体内功能弱；此外，制备的细胞因人而异，疗效难以保证。因此，亟待开发更特异性、体内杀伤肿瘤能力更强、更持久的靶向EBV抗原的细胞免疫疗法，用于EBV相关鼻咽癌或淋巴瘤的治疗。
[0004]T细胞是获得性免疫系统的重要组成部分，介导了病原体、自身病变细胞和肿瘤的清除，是维持机体稳态的防护力量。T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T细胞的身份标识，TCR通过对靶细胞主要组织相容性复合体(MHC)及所提呈的抗原复合体的识别，引发T细胞的激活和一系列后续细胞信号传递和其他生理反应，从而使得抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。TCR-T细胞疗法是将肿瘤/病毒抗原肽高特异性、高亲和力的T细胞受体克隆后，通过基因转导技术导入患者自体的T细胞，使自体T细胞可以特异的识别肿瘤/病毒的抗原多肽，进而清除肿瘤或病原体的技术。与CAR-T相比，TCR-T疗法可识别更广泛的肿瘤抗原(胞内蛋白和膜蛋白)，呈现更加强的杀伤作用的同时伴随较低细胞因子风暴，对实体瘤的治疗有更大的潜力。目前TCR-T疗法已在肺癌、结肠癌、滑膜细胞肉瘤等多种实体肿
NO：34所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2β的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示或与SEQ ID NO：35所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示或与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列具有至少80％同源性。
[0013]进一步优选的，所述的CDR1α-CDR3α及CDR1β-CDR3β选自下列任一组：
[0014]更进一步优选的，所述的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，或与SEQ ID NO：28所示氨基酸序列具有至少80％同源性；所述的β链的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，或与SEQ ID NO：27所示氨基酸序列具有至少80％同源性。
[0015]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述T细胞抗原受体氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示或与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列具有至少80％同源性。
[0016]优选的，所述T细胞抗原受体的α链和β链通过linker序列连接，linker序列优选为furin-SGSG-p2A序列(以下简写fp2A)。进一步优选的，所述的fp2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。优选的，所述的连接顺序可以为α链、fp2A、β链，或者β链、fp2A、α链。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的连接顺序为β链、fp2A、α链。
[0018]优选的，所述的T细胞抗原受体通过MHC或多聚体复合物的呈递，与EBV潜伏期膜蛋白LMP2特异性结合。其中，所述的多聚体复合物包含抗原肽，所述的抗原肽包含SEQ ID NO：5或6。优选的，所述的多聚体复合物还包括单体，生物素分子，以及链霉亲和素分子或亲和素分子，其中，所述单体包括MHC分子α链胞外区和β2m链，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。
[0019]本专利技术的第二方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合EBV潜伏期膜蛋白LMP2，其中，所述LMP2的结合表位包含SEQ ID NO：5或6。
[0020]优选的，所述抗体或其抗原结合片段包含α链的CDR1α-CDR3α和/或β链的CDR1β-CDR3β。其中，CDR1α的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示或与SEQ ID NO：31所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2α的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示或与SEQ ID NO：32所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3α的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示或与SEQ ID NO：33所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR1β的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示或与SEQ ID NO：34所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2β的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示或与SEQ ID NO：35所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示或与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列具有至少80％同源性。
[0021]更优选的，所述的CDR1α-CDR3α及CDR1β-CDR3β如SEQ ID NO：31-36所示。更进一步优选的，所述抗体或其抗原结合片段氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示或与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列具有至少80％同源性。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种T细胞抗原受体，其特征在于，所述的T细胞抗原受体特异性结合EBV潜伏期膜蛋白LMP2，其中，所述LMP2的结合表位包含SEQ ID NO：5或6。2.根据权利要求1所述的T细胞抗原受体，其特征在于，其包含α链的CDR1α-CDR3α和β链的CDR1β-CDR3β，其中，CDR1α的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示或与SEQ ID NO：31所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2α的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示或与SEQ ID NO：32所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3α的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示或与SEQ ID NO：33所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR1β的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示或与SEQ ID NO：34所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2β的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示或与SEQ ID NO：35所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示或与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列具有至少80％同源性；优选的，所述的CDR1α-CDR3α及CDR1β-CDR3β选自下列任一组：；更优选的，所述的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，或与SEQ ID NO：28所示氨基酸序列具有至少80％同源性；所述的β链的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，或与SEQ ID NO：27所示氨基酸序列具有至少80％同源性；最为优选的，所述T细胞抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示或与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列具有至少80％同源性。3.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1-2任一所述的T细胞抗原受体。4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含权利要求3所述的核酸。5.一种宿主细胞或免疫细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的表达载体，所述的免疫细胞表达权利要求1-2任一所述的T细胞抗原受体。6.一种重组T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)从阳性T细胞克隆得到权利要求3的核酸序列；2)分离、培养原代T细胞；3)将步骤1)得到的核酸序列递送至步骤2)所述的原代T细胞中，获得表达权利要求1-2任一所述T细胞抗原受体的重组T细胞。7.一种T细胞抗原受体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从阳性T细胞克隆得到权利要求3的核酸序列；...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾乐梅，陈花，李文忠，王嘉盛，雷蕾，刘芳，赵学强，林欣，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：