嵌合衔接子和激酶信号传导蛋白及其在免疫疗法中的用途制造技术

本发明专利技术提供了一种嵌合多肽，包括(a)细胞外靶向结构域；(b)跨膜结构域；(c)细胞内T细胞激活接头(LAT)结构域或SLP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合衔接子和激酶信号传导蛋白及其在免疫疗法中的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年3月15日提交的美国临时申请号62/819,386的权益，其通过引用以其全文并入本文。


[0003]本公开内容涉及嵌合衔接蛋白，其在一些实例中包括T细胞激活接头(LAT)结构域，以及它们在免疫疗法中的用途。
[0004]政府支持致谢
[0005]本专利技术是由美国国立卫生研究院、国立癌症研究所在项目编号Z01 BC 010304的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。

技术介绍

[0006]嵌合抗原受体(CAR)是由肿瘤抗原特异性抗体片段组成的分子，其融合到跨膜结构域和T细胞信号传导部分。当在T细胞表面表达时，CAR介导与靶标的结合并激活T细胞，最终诱导靶细胞裂解。CAR正在成为治疗血液系统恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)的一种有前景的方法，并且也正在测试使用CAR治疗实体瘤。然而，T细胞耗竭仍是CAR
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T疗法中的挑战。

技术实现思路

[0007]仍需要用于治疗实体瘤以及血液系统恶性肿瘤的有效免疫疗法。本文公开了可用于治疗癌症(包括血液恶性肿瘤和实体恶性肿瘤)的免疫疗法方法中的嵌合衔接蛋白(CAP)。
[0008]公开了嵌合多肽(CAP)，包括(a)细胞外靶向结构域；(b)跨膜结构域；(c)细胞内T细胞激活接头(LAT)结构域；和(d)细胞内ZAP70结构域，其中(a)
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(d)按N端到C端的顺序。在其他实施方案中，LAT结构域被SLP
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76结构域替换。在进一步的实施方案中，CAP进一步包括细胞内信号传导结构域(例如41BB或CD28细胞内信号传导结构域)，其是跨膜结构域的C端和LAT或SLP
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76结构域的N端。在一些实施方案中，嵌合多肽进一步包括铰链结构域(例如CD8或CD28铰链结构域)，其是细胞外靶向结构域的C端和跨膜结构域的N端。在另外的实施方案中，嵌合多肽进一步包括信号序列结构域(例如GM
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CSF信号序列)，其是细胞外靶向结构域的N端。接头(例如，间隔区)可以存在于公开的CAP的任何组件之间，例如，以实现CAP的正确折叠和/或功能。
[0009]在另外的实施方案中，CAP是嵌合多肽，包括(a)细胞外靶向结构域；(b)跨膜结构域；(c)细胞内ZAP70结构域，其中(a)
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(c)按N端到C端的顺序。在一些实施方案中，CAP进一步包括41BB或CD28细胞内信号传导结构域，其在跨膜结构域的C端和ZAP70结构域的N端。在一些实施方案中，CAP进一步包括铰链结构域，其是细胞外靶向结构域的C端和跨膜结构域的N端。在另外的实施方案中，CAP进一步包括信号序列结构域，其是细胞外信号传导结构域
的N端。接头(例如，间隔区)可以存在于公开的CAP的任何组件之间，例如，以实现CAP的正确折叠和/或功能。
[0010]在一些实例中，细胞外靶向结构域是抗体、抗原结合结构域或scFv，其结合目标靶蛋白，例如肿瘤相关抗原(例如，癌细胞表达的抗原)。在非限制性实例中，细胞外靶向结构域结合CD19、CD22或BCMA。在一些实例中，跨膜结构域是CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或LAT跨膜结构域。在另外的实例中，LAT结构域是全长LAT多肽，或是LAT的氨基酸34
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233。在其他实例中，ZAP70结构域包括ZAP70激酶结构域(KD)、ZAP70结构域间B(IB)或其组合。
[0011]在一些实施方案中，本文公开的CAP包括SEQ ID NO:5、7、9、16、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中任一项的氨基酸序列。
[0012]还公开了编码本文提供的CAP的核酸分子。在一些实施方案中，CAP包括SEQ ID NO:6、8、10、15、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50中任一项的核酸序列。在另外的实施方案中，核酸分子被包括在表达载体(例如慢病毒或逆转录病毒载体)中。提供了表达CAP的分离的细胞(例如T细胞或自然杀伤细胞)，以及包括细胞和药学上可接受的载体的组合物。
[0013]进一步提供了治疗癌症(例如血液恶性肿瘤或实体瘤)受试者的方法。此类方法包括向受试者施用本文公开的分离的细胞或组合物。在一些实例中，细胞是表达CAP的T细胞，例如自体T细胞。在其他实例中，细胞是表达CAP的NK细胞，例如自体NK细胞。
[0014]从以下参照附图进行的详细描述中，本公开的前述和其他特征将变得更加明显。
附图说明
[0015]图1A
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1D是显示CD4 CAP表征的一系列组图。图1A是包括CD4细胞外结构域(ED)和全长(FL)LAT(CD4
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LAT)或CD4
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ED、FLLAT和ZAP70激酶结构域(KD)(CD4
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CAP)的基于LAT的构建体的示意图。这些构建体包括CD4信号序列和LAT TM结构域。表达TCRζ
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Emerald的E6.1 JurkatT细胞在包被抗CD3抗体(HIT3)的盖玻片上被激活(图1B)。表达CD4
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LAT和GRB2
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Emerald(图1C)或CD4
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CAP
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GFP(图1D)的E6.1 JurkatT细胞在包被抗CD4抗体(OKT4)的盖玻片上被激活。
[0016]图2A和2B是显示在包被抗CD4抗体(OKT4)的盖玻片(图2A)或包被抗CD45(左)或抗CD43(右)的盖玻片(图2B)上激活的表达CD4
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CAP
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GFP的E6.1 Jurkat T细胞中的微团簇的组图。
[0017]图3A和3B是显示在包被抗CD4抗体(OKT4)的盖玻片上激活的表达TCRζ
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Halo和CD4
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CAP
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GFP(图3A)或ZAP70
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Halo和CD4
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CAP
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GFP(图3B)的E6.1 Jurkat T细胞中的微团簇的组图。
[0018]图4A
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4C是显示在包被抗CD4抗体(OKT4)的盖玻片上激活的表达CD4
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CAP
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GFP和PLCγ1
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Halo(图4A)、SLP76
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Halo(图4B)或GRB2
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Halo(图4C)的E6.1 Jurkat T细胞中微团簇形成的一系列组图。
[0019]图5A
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5B是抗CD19
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合多肽，包括：(a)细胞外靶向结构域；(b)跨膜结构域；(c)细胞内T细胞激活接头(LAT)结构域或SLP
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76结构域；和(d)细胞内ZAP70结构域，其中(a)
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(d)按N端到C端的顺序。2.一种嵌合多肽，包括：(a)细胞外靶向结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内ZAP70结构域，其中(a)
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(c)按N端到C端的顺序。3.根据权利要求1或权利要求2所述的嵌合多肽，进一步包括铰链结构域，其中所述铰链结构域是所述细胞外靶向结构域的C端和所述跨膜结构域的N端。4.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域是CD8铰链结构域或CD28铰链结构域。5.根据权利要求3或权利要求4所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域包括SEQ ID NO:17的氨基酸270
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308、SEQ ID NO:25的氨基酸266
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312或EEA的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合多肽，进一步包括信号序列结构域，其中所述信号序列是所述细胞外靶向结构域的N端。7.根据权利要求6所述的嵌合多肽，其中所述信号序列结构域是人粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)信号序列。8.根据权利要求6或权利要求7所述的嵌合多肽，其中所述信号序列结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列或SEQ ID NO:17的氨基酸1
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22的氨基酸序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞外靶向结构域包括与目标靶蛋白结合的抗原结合结构域或scFv。10.根据权利要求9所述的嵌合多肽，其中所述目标靶蛋白是肿瘤相关抗原。11.根据权利要求10所述的嵌合多肽，其中所述目标靶蛋白包括以下项中的一种或更多种：CD19、CD22、B细胞成熟因子(BCMA)、CD171、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、白细胞介素
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13受体α(IL
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13Ra)、间皮素、粘蛋白16、粘蛋白1、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR
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1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、CD33、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、CD123、CD70、人表皮生长因子受体2(HER2)、癌胚抗原(CEA)、GPTase激活蛋白(GAP)、CD5、CD38、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、成纤维细胞激活蛋白α(FAP)、神经节苷脂G2(GD2)、上皮细胞粘附分子(EpCam)、CD133和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)。12.根据权利要求9至11中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞外靶向结构域结合CD19。13.根据权利要求12所述的嵌合多肽，其中所述细胞外靶向结构域结合CD19并且包括SEQ ID NO:17的氨基酸23
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267的氨基酸序列。14.根据权利要求1至13中任一项所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或LAT跨膜结构域。15.根据权利要求14所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:25的氨基酸313
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336、SEQ ID NO:17的氨基酸309
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335、或SEQ ID NO:15的氨基酸271
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295的氨基酸序
列。16.根据权利要求1至15中任一项所述的嵌合多肽，其中所述LAT结构域包括SEQ ID NO:5的氨基酸276
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507的氨基酸序列或SEQ ID NO:17的氨基酸336
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535的氨基酸序列。17.根据权利要求16所述的嵌合多肽，其中所述LAT结构域在酪氨酸残基处包括一个或更多个取代。18.根据权利要求1至15中任一项所述的嵌合多肽，其中所述SLP
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76结构域包括SEQ ID NO:14的氨基酸2
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533的氨基酸序列。19.根据权利要求1至18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述ZAP70结构域包括ZAP70激酶结构域或ZAP70结构域间B和ZAP70激酶结构域。20.根据权利要求19所述的嵌合多肽，其中所述ZAP70激酶结构域包括SEQ ID NO:5的氨基酸527
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789的氨基酸序列并且所述ZAP70结构域间B包括SEQ ID NO:9的氨基酸522
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604的氨基酸序列。21.根据权利要求19或权利要求20所述的嵌合多肽，其中所述ZAP70结构域在对应于SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：