一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法技术

本发明专利技术提供一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法，依次通过材料与预处理、悬浮培养促发、细胞悬浮培养的建立、悬浮细胞继代增殖、悬浮细胞延时培养与花青素生产及悬浮细胞系保持等步骤来获取刺葡萄悬浮细胞系；其将在固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养的刺葡萄愈伤组织接种到液体培养基中，于摇床振荡培养，将获得的种子细胞进一步培养，建立细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞系，在此基础上进行增殖和长期继代保持。本发明专利技术可以在短时间内建立细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞系，该细胞系有很强的花青素合成能力，具有高产花青素且高增殖效率、能长期继代保持的特点。保持的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，尤其涉及一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法。

技术介绍

[0002]花青素是一种天然的食用色素，具有安全，无毒的特点。花青素虽然广泛地存在于天然植物中，但依赖天然植物提取花青素具有局限性。目前花青素植物提取的主要来源于葡萄酒行业的葡萄皮。原花青素可作为天然的食源性防腐剂主要来源是松树皮和葡萄籽。在食品加工和保健品等行业对花青素和原花青素的需求日益增加，原有的来源途径不足以满足市场需求。因此，在“低碳经济”的条件下，必须寻求更广泛的材料来生产葡萄生物活性物质。利用植物细胞培养技术离体培养植物细胞，获得次生代谢产物高产细胞系；改进培养条件和技术；设计适合植物细胞培养的发酵罐等的研究是目前植物生物
工业化生产次生代谢产物的研究热点。次生代谢产物是植物的主要活性成分，根据不完全统计已经从植物细胞培养中分离出了600种以上次生代谢产物，其中一部分次生代谢含量超过或等同于原植株的含量。利用本实验室已建立的高产花青素和原花青素的刺葡萄松散型红色愈伤组织，进一步建立刺葡萄愈伤组织高产花青素悬浮培养体系，能够快速高效的生产天然花青素等次生代谢产物，加快葡萄次生代谢物提取的发展。为进行葡萄细胞工业化生产花青素提供理论基础和技术平台。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法，利用该专利技术可快速、高效、短周期的生产葡萄天然生物活性物质，为花青素等天然生物活性物质工厂化的快速生产开辟新途径。
[0004]本专利技术是这样实现的：
[0005]一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法，包括如下步骤：
[0006](1)材料与预处理：以长期继代保存的紫红色刺葡萄愈伤组织细胞系为材料，挑选紫红色均匀的、生长状态一致的刺葡萄愈伤组织，于同一种继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3代，使刺葡萄愈伤组织生长状态达到同步化，愈伤组织团松散、紫红色均匀、绝大部分细胞呈圆形；
[0007](2)悬浮培养促发：在固体培养基上进行对数细胞同步增殖培养的第4代刺葡萄愈伤组织，培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织，放入装有液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻夹散愈伤组织团，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间12h/天的条件下，摇床转速120rpm，振荡培养；
[0008](3)细胞悬浮培养的建立：取经悬浮促发获得的分散性较好的刺葡萄悬浮细胞，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，接种到新的液体培养基中培养10天后，进行继代培养，获得细胞悬浮液种子细胞；
[0009](4)悬浮细胞继代增殖：将获得的刺葡萄细胞悬浮液种子细胞，每隔10天按步骤(3)操作方式继代增殖；
[0010](5)悬浮细胞延时培养与花青素生产：将增殖培养后的刺葡萄悬浮细胞进行延时培养，即将增殖后的细胞继续培养至20天，达到悬浮细胞生长的稳定期，此时细胞中花青素含量也达到稳定期；
[0011](6)悬浮细胞系长期保持：采用对数中期细胞隔代交替继代培养，按步骤(3)操作方式，选择对数生长期中期即培养10天的刺葡萄悬浮细胞进行继代，并在1号液体培养基和2号液体培养基中采取隔代交替继代培养，即可长期继代保持刺葡萄悬浮细胞系；
[0012]所述1号液体培养基为MS基本培养基附加1.0mg/L2,4
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D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0；所述2号液体培养基为MS基本培养基附加附加1.0mg/L2,4
‑
D、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。
[0013]进一步地，当步骤(2)进行促发培养时，需间隔快速振摇，即接种后的刺葡萄细胞悬浮液，每隔6～8个小时，将培养瓶从摇床取出，用手快速摇动，将沾粘在瓶壁上的细胞洗涤入液体培养基，每天重复该操作3～4次，如此反复，直至悬浮促发的完成。
[0014]进一步地，所述步骤(3)的具体操作如下：从摇床中取出培养瓶至超净工作台中，用手快速摇匀，利用灭菌的移液器移取种子细胞悬浮液，转入8倍体积的新鲜的液体培养基中进行培养，期间确保较大的细胞团不被转移；悬浮细胞经4天培养进入对数生长期，培养至10天进入对数生长期中期，此时悬浮细胞分散、细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛，即为刺葡萄细胞悬浮液种子细胞；如此重复培养4～5代，即可获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞。
[0015]进一步地，所述步骤(6)中对数细胞隔代交替继代培养方式如下：将处于对数生长期中期的刺葡萄悬浮细胞，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，接种到1号液体培养基中继代培养2～3代，然后转入2号液体培养基中继代培养1代，如此返复，即可长期继代保持刺葡萄悬浮细胞系。
[0016]进一步地，步骤(1)所述固体培养基为MS基本培养基附加1.0mg/L2,4
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D、30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂粉的培养基，pH调整至6.0；
[0017]所述液体培养基为MS基本培养基附加1.0mg/L2,4
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D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0。
[0018]本专利技术具有如下优点：
[0019]1.刺葡萄悬浮细胞生产花青素周期短、生长迅速、花青素产量高，培养20天的生物量是起始接种量的9.56倍，细胞花青素含量可达146.62μg/g(FW)；2、建立的悬浮细胞系在长期(培养70代)生产原花青素等生物活性物质较为稳定；3、无时间限制，可进行周年不间断生产；4、刺葡萄悬浮细胞系增殖效率高，可实现指数级增殖，可在生物发酵罐中进行规模化工厂化生产天然花青素。
【具体实施方式】
[0020]下面将结具体实施方式对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的
条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0021]一、刺葡萄愈伤组织细胞系的选取与处理
[0022]1、刺葡萄悬浮细胞系的建立是以长期继代保持的紫红色刺葡萄愈伤组织为材料。
[0023]2、在超净工作台中，挑选紫红色均匀的、生长状态一致且旺盛生长的刺葡萄愈伤组织，于同一继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养。
[0024]3、在进行刺葡萄愈伤组织对数细胞同步增殖培养时，继代接种愈伤组织所培养天数设3个时间，分别为15天、18天和20天。不同继代时间的试验结果表明，以15天为继代周期，刺葡萄愈伤组织处于缓慢生长期后期，此时愈伤组织生物量小，细胞较脆弱，镊子的外力夹取，细胞容易受伤而褐变，影响后期的培养；以18天为继代周期，刺葡萄愈伤组织进入快速生长的对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)材料与预处理：以长期继代保持的紫红色刺葡萄愈伤组织细胞系为材料，挑选紫红色均匀的、生长状态一致的刺葡萄愈伤组织，于同一种固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3代，使刺葡萄愈伤组织生长状态达到同步化，愈伤组织团松散、紫红色均匀、绝大部分细胞呈圆形；(2)悬浮培养促发：将在固体培养基上进行对数细胞同步增殖培养的第4代刺葡萄愈伤组织培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织，放入装有液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻夹散愈伤组织团，于25℃，光照强度2000～3000Lux，光照时间12h/天的条件下，摇床转速120rpm，振荡培养；(3)细胞悬浮培养的建立：取经悬浮促发获得的分散性较好的刺葡萄悬浮细胞，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，接种到新的MS液体培养基中培养10天后，进行继代培养，获得刺葡萄细胞悬浮液种子细胞；(4)悬浮细胞继代增殖：将获得的刺葡萄细胞悬浮液种子细胞，每隔10天按步骤(3)操作方式继代增殖；(5)悬浮细胞延时培养与花青素生产：将增殖培养后的刺葡萄悬浮细胞进行延时培养，即将增殖后的细胞继续培养至20天，达到悬浮细胞生长的稳定期，此时细胞中花青素含量也达到稳定期；(6)悬浮细胞系长期保持：采用对数中期细胞隔代交替继代培养，按步骤(3)操作方式，选择对数生长期中期即培养10天的刺葡萄悬浮细胞进行继代，并在1号液体培养基和2号液体培养基中采取隔代交替继代培养，即可长期继代保持刺葡萄悬浮细胞系；所述1号液体培养基为MS基本培养基附加1.0mg/L2,4
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D、30g/L蔗糖的培养基，pH调整至6.0；所述2号液体培养基为MS基本培养基附加1.0mg/L2,4
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D、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖的培...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖呈纯，潘红，赖恭梯，张静，黄贤贵，高慧颖，王琦，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：