一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用。本发明专利技术通过对来源于毛竹胚性愈伤组织的原生质体进行培养，诱导其再生出完整的细胞壁，再生效果优良且成功率高，同时再生结果还具有较高的重复性。此外，利用本发明专利技术的方法还可以对原生质体及细胞壁再生过程进行监测，为研究毛竹以及其他物种细胞壁合成与调控机理、材质改良以及生物质能源等领域的研究提供切实可行的模型，为改善竹材细胞壁的质量与产量提供了理论指导，对竹产业的建设发展具有深远影响和长远意义。有深远影响和长远意义。

【技术实现步骤摘要】
protoplasts of suspension
‑
cultured Bambusa cells.Botanical Bulletin of Academia Sinica,31:29
‑
34)。
[0010]2005年，Science杂志在其创刊125周年时提出把“植物如何形成细胞壁”作为接下来25年需要解决的重要科学问题之一。而且植物细胞壁是被了解最少的细胞结构，人们对细胞壁的利用率还不到其年产量的2％。
[0011]2010年，Hisamoto和Kobayashi从Lithachne pauciflora、Phyllostachys meyeri、Sasa jotanii和Bambusa vulgaris四种竹类植物的嫩叶中分别游离出原生质体(Hisamoto Y,Kobayashi M(2010)Protoplast isolation from bamboo leaves.Plant Biotechnology,27:353
‑
358)。
[0012]禾本科植物的组培及原生质体培养技术相较于双子叶植物，难度更大。竹类植物的原生质体培养技术及细胞壁再生研究仍存在很大局限性，仅在少数竹种中展开实验。毛竹(Phyllostachys edulis)作为重要的非木材料和木材替代品，在林业产业和生态建设中发挥重要作用，目前，还缺乏对毛竹原生质体细胞壁再生过程进行系统的动态研究报道。
[0013]毛竹种子的无菌培养污染率高、胚性愈伤组织诱导率低及非胚性愈伤组织来源的原生质体活性低等问题，严重限制了对毛竹原生质体细胞壁再生的研究。2013年，Yuan等利用毛竹种子诱导出胚性愈伤组织，经历胚状体发育后能够再生出幼苗，移栽到温室后可以正常生长(Yuan JL,Yue JJ,Wu XL,et al(2013)Protocol for Callus Induction and Somatic Embryogenesis in Moso Bamboo.Plos One,8(12):81954
‑
81958)。公开于2015年的CN 105145355A中也提到了毛竹一种原生质体培养的方法，通过对胚性愈伤组织进行酶解，将酶解后获得的原生质体进行过滤、离心和纯化，然后将纯化后的原生质体在适当的培养基上培养，使得原生质体再生细胞壁、形成胚性愈伤组织、并萌发形成再生植株，最后再生植株经过壮苗、炼苗后移栽成活。不过，已有的研究报道中所提到对毛竹原生质体进行培养的方法仍然存在重复性差、效率低、再生细胞壁困难等诸多特点。
[0014]此外，目前对毛竹细胞壁的研究多集中于解析其细胞壁的微观结构和化学组成、次生细胞壁形成及单一基因家族的功能研究等，缺乏对原生质体培养及细胞壁再生过程的整体监测和系统研究。

技术实现思路

[0015]本专利技术结合大量的理论研究和实验探索，首次提出了一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其在相关研究中的应用。
[0016]具体而言，本专利技术首先提供了一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其包括：
[0017](1)将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，以诱导得到胚性愈伤组织；
[0018]所述愈伤诱导培养基中含有200
‑
300mg/L的头孢霉素；
[0019](2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中培养，并将长出新的愈伤组织剥离并进行酶解，以得到游离的裸露原生质体；
[0020](3)利用预冷的改良的原生质体培养基重悬原生质体，并进行活化处理；
[0021]所述改良的原生质体培养基中含有1.5
‑
2.5mg/L的2,4
‑
D和0.15
‑
0.25mg/L的6
‑
BA；所述活化处理具体为：在43
‑
47℃热激处理4.5
‑
5.5min，然后在
‑
2～4℃处理5
‑
15s；
[0022](4)将活化处理后的原生质体接种于所述改良的原生质体培养基进行培养。
[0023]本专利技术发现，通过上述方法，尤其在胚性愈伤组织的诱导阶段(即本专利技术的步骤(2))及原生质体的活化和培养阶段(即本专利技术的步骤(3)～(4))分别对愈伤诱导培养基及原生质体培养基进行改良后，可以大幅改善毛竹的原生质体及细胞壁的再生效果及成功率，同时其再生结果也具有良好的重复性。
[0024]其中，毛竹种子的表面和胚乳易受真菌和细菌的污染，使得在无菌操作中污染率较高。目前，还没有针对毛竹种子内源细菌进行消毒的文献。通过在愈伤诱导培养基中加入200
‑
300mg/L的头孢霉素，可有效抑制毛竹种子中内源细菌的污染，抑菌率可达95％以上。通过在原生质体培养基中加入1.5
‑
2.5mg/L的2,4
‑
D和0.15
‑
0.25mg/L的6
‑
BA，可以大幅提升毛竹原生质体的细胞壁再生率。
[0025]本领域人员可根据常识设置培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法中所涉及的其他试剂、培养基及具体操作，均可以获得上述所提到的效果。不过，为了进一步优化毛竹原生质体及细胞壁的再生效果，本专利技术对影响其再生效果的关键因素进行了进一步探究与优化。
[0026]作为优选，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基中含有MS培养基(4.43g/L MS)、4
‑
6mg/L 2,4
‑
D、300
‑
500mg/L脯氨酸、300
‑
500mg/L谷氨酰胺、100
‑
300mg/L水解酪蛋白、50
‑
100mg/L肌醇、50
‑
100mg/LPVP
‑
40、25
‑
35g/L蔗糖、2
‑
2.5g/L植物凝胶、200
‑
300mg/L头孢霉素，pH值为5.75
‑
5.80。
[0027]作为优选，步骤(1)中，通过以下方式对毛竹种子进行消毒：
[0028]将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20
‑
28h后，用180
‑
220mg/L的赤霉素溶液再浸泡1.5
‑
2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70
‑
80％酒精浸泡0.5
‑
1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8
‑
2.2％有效氯和0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的次氯酸钠消毒液浸泡18
‑
25min，用无菌水清洗；再用含0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的0.1％氯化汞浸泡18
‑
25mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，其包括：(1)将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，以诱导得到胚性愈伤组织；所述愈伤诱导培养基中含有200
‑
300mg/L的头孢霉素；(2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中培养，并将长出新的愈伤组织剥离并进行酶解，以得到游离的裸露原生质体；(3)利用预冷的改良的原生质体培养基重悬原生质体，并进行活化处理；所述改良的原生质体培养基中含有1.5
‑
2.5mg/L的2,4
‑
D和0.15
‑
0.25mg/L的6
‑
BA；所述活化处理具体为：在43
‑
47℃热激处理4.5
‑
5.5min，然后在
‑
2～4℃处理5
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15s；(4)将活化处理后的原生质体接种于所述改良的原生质体培养基进行培养。2.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基中含有MS培养基、4
‑
6mg/L 2,4
‑
D、300
‑
500mg/L脯氨酸、300
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500mg/L谷氨酰胺、100
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300mg/L水解酪蛋白、50
‑
100mg/L肌醇、50
‑
100mg/L PVP
‑
40、25
‑
35g/L蔗糖、2
‑
2.5g/L植物凝胶、200
‑
300mg/L头孢霉素，pH值为5.75
‑
5.80。3.根据权利要求1或2所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过以下方式对毛竹种子进行消毒：将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20
‑
28h后，用180
‑
220mg/L的赤霉素溶液再浸泡1.5
‑
2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70
‑
80％酒精浸泡0.5
‑
1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8
‑
2.2％有效氯和0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的次氯酸钠消毒液浸泡18
‑
25min，用无菌水清洗；再用含0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的0.1％氯化汞浸泡18
‑
25min，最后用无菌水清洗；和/或，步骤(1)中，在每个培养器皿中单独接种一个经过消毒的毛竹种子。4.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述愈伤组织增殖培养基中含有MS培养基、1
‑
3mg/L 2,4
‑
D、300
‑
500mg/L脯氨酸、300
‑
500mg/L谷氨酰胺、100
‑
300mg/L水解酪蛋白、100
‑
200mg/L肌醇、50
‑
100mg/L PVP
‑
40、5
‑
10mg/L抗坏血酸、25
‑
35g/L蔗糖、2
‑
2.5g/L植物凝胶，pH值为5.75
‑
5.80。5.根据权利要求1或4所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，在步骤(2)的所述酶解中，所使用的酶解液中含有2.0
±
0.5％的纤维素酶Cellulose R
‑
10、1.0
±
0.5％的半纤维素酶Hemicellulase、1.0
±
0.5％的离析酶Macerozyme R
‑
10、1.0
±
0.5％的果胶酶Pectolyase Y
‑
23、0.5
‑
0.7M的甘露醇、18
‑
22mM的MES、18
‑
22mM的KCl、0.008
‑
0.012M的CaCl2、0.18
‑
0.22％的BSA，pH值为5.75
‑
5.80；和/或，所述酶解的条件为24
±
2℃、80
‑
120rpm/min下避光酶解。6.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，在步骤(2)中的酶解结束后，将酶解液冷却至0
‑
6℃，而后与预冷的W5溶液混合，并用80
‑
120目的细胞筛过滤混合液；收集滤液并在0
‑
6℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清；而后再利用预冷的改良的原生质体培养基重悬沉淀；优选所述W5溶液中含有8
‑
10g/L的NaCl、0.12
‑
0.13M CaCl2、4
‑
6mM KCl、1.5
‑
2.5mM MES和1.5
‑
2.0g/L的葡萄糖。7.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(3)
‑
(4)中，所述改良的原生质体培养基是以KM8p培养基为基础，添加35
‑
45g/L甘露醇、
15
‑
25mL/L椰乳、0.20
‑
0.30g/L酶水解酪蛋白、1.5
‑
2.5mg/L的2,4
‑
D、0.15
‑
0.25mg/L的6

【专利技术属性】
技术研发人员：卢存福，耿新，陈玉珍，王晓静，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：