一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法，属于植物生物技术领域。本发明专利技术方法包括以下步骤：对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集组培苗完全展开的叶片；去掉采集叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h；吸出EME培养基、加入酶液；无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h；将酶解后的溶液通过无菌筛过滤，滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体。通过本发明专利技术方法获得的原生质体形态完整、稳定，产量高达2.8

【技术实现步骤摘要】
一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法


[0001]本专利技术属于植物生物
，涉及原生质体的分离与纯化，更具体的涉及一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法。

技术介绍

[0002]油茶广泛分布于我国南方多省，是我国重要的木本油料树种，无论种植面积还是产量均居木本食用油料首位。在维护我国粮油安全、精准扶贫和美丽乡村建设中发挥了重要作用。茶油中油酸和亚油酸含量达80％以上，风味独特，营养丰富，耐贮藏，易被人体吸收，是优质食用油之一，故被誉为“东方橄榄油”。茶油的价值不仅体现在食用方面，还体现在医疗、保健和美容，具有消炎、降血脂、软化血管、抗氧化以及抗癌等多种功能。
[0003]目前油茶品种繁多，但高产、抗逆性强的品种仍然十分有限。由于油茶童期长且基因高度杂合，常规育种如选择育种与杂交育种效率低，亟需更加高效的育种途径，加快油茶育种进程。由于原生质体具有全能性，通过酶解法得到的原生质体进行培养，有获得再生植株的潜能。原生质体融合(体细胞杂交)技术也在不断发展，通过原生质体融合再生的杂交植株，有助于突破有性杂交障碍，进行远缘杂交实现胞质基因组的重组交换，染色体加倍，获得异源多倍体。因此，开展油茶原生质体分离和细胞融合研究，在油茶的品种改良上具有广阔的应用前景。
[0004]在木本植物中，原生质体分离技术起步比较晚，柑橘原生质体分离体系最先建立。目前，体细胞融合技术，在柑橘上已获得几百个体细胞杂种，有些已应用于新品种选育、三倍体育种、砧木选育等方面；在杨树、苹果、枣、杉木等木本植物上也取得了不错进展。
[0005]油茶原生质体分离技术也已有报道，专利申请CN111705033A“一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法”，公开了一种油茶愈伤组织悬浮培养及原生质体的制备和纯化方法，原生质体数量可达1.17
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107个/g
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FW，为了后期进行不同源原生质体融合和培养的研究，需要建立悬浮系之外的原生质体分离体系。机械法进行油茶叶肉原生质体的制备已有报道，通过机械法制备的原生质体不会受酶等化学试剂的伤害，所需费用低，原生质体产量达到5.1
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105个/g
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FW，相对较低。相比机械法而言，酶解法操作简单，获得的原生质体产量多，目前植物原生质体分离、细胞融合等研究大多数均采用酶解法制备原生质体。而采用酶解法制备油茶叶肉原生质体的研究目前尚未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，包括以下步骤：
[0009](1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的叶片。该步骤中，油茶组培苗黑暗预处理的时间优选为24h。
[0010](2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h。然后吸出EME培养基、加入酶液。无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h。
[0011]所述的酶液与EME培养基的pH调为5.5～6.0；其中，酶液：10～15g/L纤维素酶R
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10(YAKULT，Japan)、5～10g/L离析酶R
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10(YAKULT，Japan)、2.5～5g/L蜗牛酶(上海如吉生物科技)、0.6g/L MES(2
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(N
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吗啉)乙磺酸一水合物)、1.8g/L二水合氯化钙、0.055g/L二水合磷酸二氢钠、27.325～54.62/L甘露醇(摩尔浓度0.15～0.3M)，51.345～102.69g/L蔗糖(摩尔浓度0.15～0.3M)，1/2MS培养基(所有元素减半)，250mg/L ME，0.22μm过滤灭菌，现用现配；EME培养基：MS培养基+500mg/L ME(麦芽提取物)+102.69～205.38g/L蔗糖(摩尔浓度0.3～0.6M)，高温高压灭菌。
[0012]该步骤中，负压下抽真空的时间优选为20min；酶液中纤维素酶R
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10、离析酶R
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10、蜗牛酶的浓度分别优选为15g/L、5g/L、2.5g/L；酶液中甘露醇的浓度优选为36.43g/L(摩尔浓度0.2M)、蔗糖的浓度优选为68.46g/L(摩尔浓度0.2M)，EME培养基中蔗糖的浓度优选为136.92g/L(摩尔浓度0.4M)；酶解优选在26～30℃的黑暗条件下进行，酶解的时间优选为10h。
[0013](3)将步骤(2)酶解后的溶液通过无菌筛过滤，除去未酶解的叶片以及破裂细胞等杂质。滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置待原生质体沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体，原生质体用MMg缓冲液保存。其中，W缓冲溶液组成：2mmol/L MES、125mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl、154mmol/L NaCl、5mmol/L葡萄糖，用1mol/L的HCl和KOH调pH为5.6～6.0；MMg缓冲液组成：4mmol/L MES、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L MgCl2，用1mol/L的HCl和KOH调pH为5.6～6.0，高温高压灭菌。
[0014]该步骤中，无菌筛的孔径优选为200目；离心的条件优选为100～400r/min离心2～6min；冰上静置的时间优选为10～20min。
[0015]进一步地，所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，包括以下步骤：
[0016](1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的第一片叶片。
[0017](2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成0.5～1mm宽的叶条，迅速放入含10ml EME培养基的无菌小瓶中，盖上封瓶膜，负0.07MPa条件下抽真空10min～1h。然后吸出EME培养基，加入10ml的酶液。无菌小瓶用封口膜封口后在30～50rpm、26～30℃的黑暗条件下酶解6～14h。
[0018]该步骤中，负0.07MPa条件下抽真空的时间优选为20min；酶液中纤维素酶R
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10、离析酶R
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10、蜗牛酶的浓度分别优选为15g/L、5g/L、2.5g/L；酶液中甘露醇的浓度优选为36.43g/L(摩尔浓度0.2M)、蔗糖的浓度优选为68.46g/L(摩尔浓度0.2M)，EME培养基中蔗糖的浓度优选为136.92g/L(摩尔浓度0.4M)；酶解优选在26～30℃的黑暗条件下进行，酶解的时间优选为10h。
[0019](3)将步骤(2)酶解后的溶液通过200目无菌筛过滤，除去未酶解的叶片以及破裂细胞等杂质，收集滤液于离心管。滤液于200～400r/min离心3～6min，去除上清液，轻柔地加入4ml W缓冲液悬浮原生质体，100～300r/min离心2～4mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的叶片；(2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h；然后吸出EME培养基、加入酶液；无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h；所述的酶液与EME培养基的pH调为5.5～6.0；其中，酶液：10～15g/L纤维素酶R
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10、5～10g/L离析酶R
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10、2.5～5g/L蜗牛酶、0.6g/L MES、1.8g/L二水合氯化钙、0.055g/L二水合磷酸二氢钠、27.325～54.62/L甘露醇、51.345～102.69g/L蔗糖、1/2MS培养基、250mg/L ME；EME培养基：MS培养基+500mg/L ME+102.69～205.38g/L蔗糖；(3)将步骤(2)酶解后的溶液通过无菌筛过滤，滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置待原生质体沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体；其中，W缓冲溶液：2mmol/L MES、125mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl、154mmol/L NaCl、5mmol/L葡萄糖，用1mol/L的HCl和KOH调pH为5.6～6.0。2.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(1)中，油茶组培苗黑暗预处理的时间为24h。3.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，负压下抽真空的时间为20min。4.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的酶液中纤维素酶R
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10、离析酶R
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10、蜗牛酶的浓度分别为15g/L、5g/L、2.5g/L。5.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的酶液中甘露醇的浓度为36.43g/L、蔗糖的浓度为6...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖诗鑫，李素芳，叶天文，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：