复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺技术

本发明专利技术公开了复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺，它包括以下步骤：步骤1：离体材料的制备，优选生长4年的虎眼万年青球茎，水冲洗球茎表面的附着物及泥土等杂质，放入110mg、L抗坏血酸和1％L的苯菌灵混合溶液中杀菌处理10分钟，然后用无菌磁化水洗涤10分钟。有益效果在于：本发明专利技术通过分离虎眼万年青植物的形成层作为干细胞的来源，并在培养时采用先进工艺，严格避免干细胞在培养过程中出现变异，使得最终制备的功能性食品的组合物具有较强的抗癌活性，大大提高了组合物的药用价值以及药用效果，同时采用本发明专利技术制备方法来制备功能性食品组合物，能够实现组合物的量产，便于组合物的大规模推广应用。物的大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】
复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺


[0001]本专利技术涉及到复方(干细胞)与抗癌组合物制备
，尤其涉及复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺。

技术介绍

[0002]作为生物工程学技术中的植物干细胞培养方法被世界生物界评价为不会诱发环境问题，且作为可稳定的供给植物来源有用的物质最理想的技术。从各种植物细胞系培养有价值的物质与从植物中直接提取生产方法相比之下有许多的优点，尤其是与以往的提取方法不同，它不受外部环境的影响，可持续大量的培育和生产，被认为是可解决如生态系统被破坏的问题最好的方法。尤其是那些具有较强抗癌活性而较稀缺植物资源的细胞培育与大量扩增更不为多见。这是因为，在多种复杂的细胞培养中，离体材料的褐化、细胞增殖与生产过程中细胞变异仍是失败的主要原因。
[0003]在植物全息、全能表达系统中和在利用植物细胞中，诸多的植物细胞分化组织，例如枝叶、茎、种子、根系等都是以丧失分裂能力的永久组织，所以，为将转变为具有分裂能力的细胞系必需先进行脱分化过程。所述脱分化过程是指用植物体的一种组织或某器官培养时，解决组织或细胞已经施行特定功能而分化的状态，即使这样的脱分化过程中由染色体变异还会出现细胞系的严重变异坏象，尤其是通过植物细胞培养生产过程中，只要能保证在长期培养期间稳定的维持较快细胞增殖与高的代谢物质时，其生产能力方可产业化，能够克服变异问题，在通过植物细胞培养有较高应用价值的物质生产中，获得遗传稳定的细胞系最佳工艺及方案是切实可行的。
[0004]对此，本专利技术中参考了只利用植物的茎采集的形成层而诱导愈伤组织的方法的形成层诱导了愈伤组织，愈伤组织是脱分化发生后形成的组织，对此所述方法仍存有由脱分化的细胞产生变异的问题。
[0005]但是，属于百合科的虎眼万年青植物的球茎进行离体培养其细胞系也仍然要去解决其脱分化的变异问题，以获取可稳定增殖的遗传稳定性高的细胞系。目前我国仅南方几省区的花卉苗园有零星小量栽培，要作为大量的制药和应用于临床，还存在着原料难求的局面。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺。
[0007]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0008]复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺，它包括以下步骤：
[0009]步骤1：离体材料的制备
[0010]优选生长4年的虎眼万年青球茎，水冲洗球茎表面的附着物及泥土等杂质，放入110mg、L抗坏血酸和1％L的苯菌灵混合溶液中杀菌处理10分钟，然后用无菌磁化水洗涤10
分钟，在放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，在放入30％的过氧化氢液中杀菌20分钟，然后再用无菌蒸馏水冲洗10分钟；
[0011]步骤2：固态培养基的制备
[0012](1)准备硝酸钾2510mg，硫酸胺136mg，硫酸镁123mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2.5mg，硫酸铜0.026mg，氯化钙114mg，碘化钾0.7mg，氯化钴0.026mg，磷酸二氢钠131mg，硼酸2.8mg，钼酸钠0.26mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，L
‑
抗坏血酸52mg，柠檬酸74mg，L
‑
天冬氨酸135mg，L
‑
精氨酸176mg，甘氨酸76mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2.2mg，蔗糖10.100mg，活性炭200mg，琼脂3.100mg，磁化水0.63升，备用；
[0013](2)将无机盐类各养分分别用20ml磁化水稀释，将维生素类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将氨基酸类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将生长素放入10ml无菌磁化水中稀释，然后将稀释后的无机盐类分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类、固化剂、活性炭放入，全部溶解后，封口，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素和氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；
[0014]步骤3：离体材料诱导及形成层分离培养的制备
[0015](1)将灭菌的虎眼万年青球茎用接种刀切成4段，去掉最外层，取第二层和第三层的内包层，分别切成1
‑
2cm的小方块，移入培养基中，在受控的暗室内避光培养28天，培养温度25
±
1℃，培养28天后，将形成层细胞群体用接种勺或接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内，再放大培养23天；
[0016](2)然后在将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室中，用旋转摇床以100rpm，25
±
1℃培养，传代时间为20天；
[0017]步骤4：液态培养基的制备
[0018](1)准备硫酸镁181mg，硫酸锰23mg,硫酸锌8.9mg，硫酸铜0.23mg，硝酸钙473mg，硝酸胺400mg，氯化钙60mg，碘化钾995mg，钼酸钠0.24mg，硼酸6mg，磷酸氢钠170mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，L
‑
抗坏血酸60mg，柠檬酸75mg，L天冬氨酸135mg，L
‑
精氨酸178mg，甘氨酸75mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2mg，蔗糖30.100mg，麦饭石颗粒50000mg，锗石50000mg，磁化水1升，备用；
[0019](2)将无机盐类各养分分别用20m1磁化水稀释，将维生素类合并放入50m1无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释，然后将稀释后的无机盐分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类，固化剂、活性炭放入，全部溶解后，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；
[0020]步骤5：生物反应器内的培养
[0021]将来自虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系在烧瓶的干细胞移入10升的气升式生物反应器内放大培养，培养基用表2中的液态培养基放大培养10天后，再向内加入蔗糖10g和甲基茉莉酮酸酯1mg，无菌磁化水0.5升的混合液再继续培养10天；
[0022]步骤6：细胞系的提取分离
[0023](1)将培养液用1um的过滤器过滤，滤去培养液，收集截留的细胞系黏液质，放入一不锈钢容器内封口，放入35℃冰箱内预冻2小时后，在放进液氮罐内冷冻3小时，取出，在室温下维持30分钟后，在依次预冻、冷冻2次，共计冷冻3次；
[0024](2)将冷冻3次的容器取出，室温下维持10分钟后，快速粉碎成60目粗冻粉，之后放
入80％的500ml乙醇中间接加热20℃搅拌48小时，然后放入离心机内以3.000rpm离心20分钟，取上清液；
[0025](3)将离心机内乙醇不溶物取出，在加入100ml乙醇液，放进40HZ超声波清洗机内，超声振荡10分钟，在依次离心20分钟，取上清液；
[0026本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺，其特征在于：它包括以下步骤：步骤1：离体材料的制备优选生长4年的虎眼万年青球茎，水冲洗球茎表面的附着物及泥土等杂质，放入110mg、L抗坏血酸和1％L的苯菌灵混合溶液中杀菌处理10分钟，然后用无菌磁化水洗涤10分钟，在放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，在放入30％的过氧化氢液中杀菌20分钟，然后再用无菌蒸馏水冲洗10分钟；步骤2：固态培养基的制备(1)准备硝酸钾2510mg，硫酸胺136mg，硫酸镁123mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2.5mg，硫酸铜0.026mg，氯化钙114mg，碘化钾0.7mg，氯化钴0.026mg，磷酸二氢钠131mg，硼酸2.8mg，钼酸钠0.26mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，L
‑
抗坏血酸52mg，柠檬酸74mg，L
‑
天冬氨酸135mg，L
‑
精氨酸176mg，甘氨酸76mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2.2mg，蔗糖10.100mg，活性炭200mg，琼脂3.100mg，磁化水0.63升，备用；(2)将无机盐类各养分分别用20ml磁化水稀释，将维生素类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将氨基酸类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将生长素放入10ml无菌磁化水中稀释，然后将稀释后的无机盐类分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类、固化剂、活性炭放入，全部溶解后，封口，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素和氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；步骤3：离体材料诱导及形成层分离培养的制备(1)将灭菌的虎眼万年青球茎用接种刀切成4段，去掉最外层，取第二层和第三层的内包层，分别切成1
‑
2cm的小方块，移入培养基中，在受控的暗室内避光培养28天，培养温度25
±
1℃，培养28天后，将形成层细胞群体用接种勺或接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内，再放大培养23天；(2)然后在将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室中，用旋转摇床以100rpm，25
±
1℃培养，传代时间为20天；步骤4：液态培养基的制备(1)准备硫酸镁181mg，硫酸锰23mg,硫酸锌8.9mg，硫酸铜0.23mg，硝酸钙473mg，硝酸胺400mg，氯化钙60mg，碘化钾995mg，钼酸钠0.24mg，硼酸6mg，磷酸氢钠170mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，L
‑
抗坏血酸60mg，柠檬酸75mg，L天冬氨酸135mg，L
‑
精氨酸178mg，甘氨酸75mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2mg，蔗糖30.100mg，麦饭石颗粒50000mg，锗石50000mg，磁化水1升，备用；(2)将无机盐类各养分分别用20m1磁化水稀释，将维生素类合并放入50m1无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释，然后将稀释后的无机盐分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类，固化剂、活性炭放入，全部溶解后，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；步骤5：生物反应器内的培养将来自虎眼万...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞作仁，李恩荣，王明会，杨忠荣，庞中龙，
申请(专利权)人：李恩荣，
类型：发明
国别省市：