一种蜡梅原生质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种蜡梅原生质体的制备方法，该方法包含：在黑暗条件下培养蜡梅的花药，诱导产生愈伤组织；将愈伤组织置于酶解溶液中，在振荡培养箱中黑暗培养，得到含原生质体的酶解液；其中，酶解溶液包含：纤维素酶和离析酶；在酶解液中加入适量W5溶液稀释，用细胞过滤器过滤；其中，W5溶液为氯化钠、氯化钙、氯化钾、2

【技术实现步骤摘要】
一种蜡梅原生质体的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种原生质体的制备方法，具体涉及一种蜡梅原生质体的制备方法。

技术介绍

[0002]蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科蜡梅属的名贵花木，是珍贵的冬季观花树种。近年来，人们对蜡梅的需求与日俱增，蜡梅的应用和市场不断扩大，蜡梅的性状遗传和改良成为科研和产业的重点，蜡梅作为木本植物，遗传转化体系难以建立，建立蜡梅的遗传转化体系对蜡梅花色、花香、抗逆等基因功能有重大意义，而原生质体提取正好是瞬时表达和遗传性状改良的一项基本技术。
[0003]植物的原生质体指的是植物细胞除去细胞壁后，裸露出的细胞膜包裹的原生质团部分。原生质体因为没有细胞壁隔绝外界环境，容易吸收导入的外源基因、染色体等遗传物质，能够克服有性生殖的障碍，制备时间短，能够快速观测表型，实现基因的表达，成为了分子生物相关实验中的理想受体。
[0004]蜡梅作为木本植物，生长周期长，植物结构复杂，目前还没有蜡梅原生质体制备的相关研究，仍然处于起步阶段。研究蜡梅原生质体提取技术，获取蜡梅原生质体提取的最佳材料、制备方法，对蜡梅瞬时转化体系的建立、遗传转化、体细胞杂交等有重大意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种蜡梅原生质体的制备方法，以纤维素酶和离析酶的酶解液组合，以蜡梅愈伤组织为材料制备原生质体，不受取材时间、数量的影响，酶解可得到平均1.11
×
106个/g的蜡梅原生质体产量，高效快速。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种蜡梅原生质体的制备方法，该方法包含：在黑暗条件下培养蜡梅花药，诱导愈伤组织；将所述愈伤组织置于酶解溶液中，在振荡培养箱中黑暗培养，得到含原生质体的酶解液；其中，所述酶解溶液包含：纤维素酶和离析酶，纤维素酶的浓度为1.0～2.0％，离析酶的浓度为0.1～0.5％；在酶解液中加入适量W5溶液稀释，用细胞过滤器过滤；其中，所述W5溶液为氯化钠、氯化钙、氯化钾、2
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(N
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吗啉基)乙磺酸和水的混合液；将所得滤液离心，弃上清液，以获得含蜡梅原生质体的溶液。
[0007]优选地，诱导所述蜡梅花药的培养基为MS+1.0mg/L 6
‑
BA+1.0～2.0mg/L 2,4
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D。
[0008]优选地，所述花药愈伤组织在黑暗条件下培养，温度为24
±
2℃，空气湿度为44％。
[0009]优选地，所述蜡梅花药为选取红心、素心或皱瓣基因型的蜡梅的花苞，经清洗和消毒后，取下花药；其中，所述清洗和消毒为，采用洗衣粉水浸泡，水洗，70％酒精浸泡，无菌水洗，0.1％氯化汞浸泡，无菌水洗。
[0010]优选地，所述纤维素酶的浓度为1.0％，离析酶的浓度为0.1％。
[0011]优选地，所述酶解溶液还包含：甘露醇、氯化钾、2
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(N
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吗啉基)乙磺酸、氯化钙和牛血清蛋白；其中，所述甘露醇的浓度为0.4mol/L，所述氯化钾的浓度为0.02mol/L，所述2
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(N
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吗啉基)乙磺酸的浓度为0.02mol/L，所述氯化钙的浓度为0.02mol/L，所述牛血清蛋白
的浓度为1.0％。
[0012]优选地，所述愈伤组织于酶解溶液，在振荡培养箱中黑暗培养，温度为22℃，转速为70rpm/min。
[0013]优选地，所述愈伤组织的振荡培养时间为4～6h。
[0014]优选地，所述细胞过滤器为75μm细胞过滤器。
[0015]优选地，所述滤液的离心为为：200xg离心2min。
[0016]本专利技术的蜡梅原生质体的制备方法，具有以下优点：
[0017]本专利技术以蜡梅愈伤组织为材料制备原生质体，不受取材时间、数量的影响。本专利技术以纤维素酶+离析酶的酶解液组合，酶解4小时即可得到平均1.11
×
106个/g的蜡梅原生质体产量，高效快速。本专利技术所用不同蜡梅的基因型对原生质体的产量有显著差异，其中素心的原生质体产量可高达1.56
×
106个/g。本专利技术开辟了蜡梅原生质体制备技术，在此基础上可进行原生质体培养、瞬时转化、细胞融合等操作，对蜡梅基因功能的研究和遗传性状的改良具有重要意义。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例制备原生质体的材料。
[0019]图2为本专利技术实施例制备的原生质体细胞照片(10倍)。
[0020]图3为本专利技术实施例制备的原生质体细胞照片(40倍)。
[0021]图4为本专利技术实施例中原生质体产量与纤维素酶的关系。
[0022]图5为本专利技术实施例中原生质体产量与离析酶的关系。
[0023]图6为本专利技术实施例中原生质体产量与酶解时间的关系。
[0024]图7为本专利技术实施例中原生质体产量与植物基因型的关系。
具体实施方式
[0025]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]以下实施例中使用的试剂的制备如下：
[0027]0.8M甘露醇(100mL)：称取15.18g甘露醇粉末，蒸馏水溶解后，定容至100mL，4℃冰箱保存。
[0028]10％BSA(10mL)：称取1.0gBSA粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
[0029]0.2M MES(10mL)：称取0.3g MES(2
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(N
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吗啉基)乙磺酸)粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
[0030]1M氯化钾(10mL)：称取0.75g氯化钾粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
[0031]1M氯化钙(10mL)：称取11.1g氯化钙粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
[0032]1M氯化钠(100mL)：称取5.84g氯化钠粉末，蒸馏水溶解后，定容至100mL，4℃冰箱
保存。
[0033]W5溶液(100mL)：量取1M氯化钠15.4mL，加入1M氯化钙12.5mL，1M氯化钾0.5mL，0.2M MES 1mL，混合均匀后，蒸馏水定容至100mL，4℃冰箱保存。
[0034]实施例1
[0035]蜡梅原生质体的制备，按照如下步骤：
[0036](1)设计4因素3水平的正交试验表1如下：
[0037]表1不同酶解条件的正交试验设计(L943)
[0038][0039]注：这些基因型均在华中农业大学采集。
[0040](2)配制5mL酶解液：打开水浴锅，设置为55℃备用，按照表1称取适量的纤维素酶、离析酶，加入2.5m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜡梅原生质体的制备方法，其特征在于，该方法包含：在黑暗条件下培养蜡梅花药，诱导愈伤组织；将所述愈伤组织置于酶解溶液中，在振荡培养箱中黑暗培养，得到含原生质体的酶解液；其中，所述酶解溶液包含：纤维素酶和离析酶，纤维素酶的浓度为1.0～2.0％，离析酶的浓度为0.1～0.5％；在酶解液中加入适量W5溶液稀释，用细胞过滤器过滤；其中，所述W5溶液为氯化钠、氯化钙、氯化钾、2
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吗啉基)乙磺酸和水的混合液；将所得滤液离心，弃上清液，以获得含蜡梅原生质体的溶液。2.根据权利要求1所述的蜡梅原生质体的制备方法，其特征在于，诱导所述蜡梅花药的培养基为MS+1.0mg/L 6
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BA+1.0～2.0mg/L 2,4
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D。3.根据权利要求1所述的蜡梅原生质体的制备方法，其特征在于，所述花药愈伤组织在黑暗条件下培养，温度为24
±
2℃，空气湿度为44％。4.根据权利要求1所述的蜡梅原生质体的制备方法，其特征在于，所述蜡梅花药为选取红心、素心或皱瓣基因型的蜡梅的花苞，经清洗和消毒后，取下花药；其中，所述清洗和消毒为，采用洗衣粉水浸泡，水洗，70％...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯歌，李雅迪，杨楠，赵荣，张倩，向林，陈龙清，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：