一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法，包括以下步骤：(1)狗牙根叶片撕裂成条；(2)加入纤维素酶和离析酶真空抽滤；(3)纤维素酶和离析酶孵育酶解去除细胞壁；(4)离心收集酶解的细胞；(5)洗涤细胞去除残余酶液；(6)重新离心获得原生质体细胞。本发明专利技术中的狗牙根作为一种重要的暖季型草坪草，具有常异交、倍性复杂的遗传学特点，对其进行传统杂交育种较为困难，而细胞工程育种则可以克服这些困境快速的培育新品种，而本发明专利技术的狗牙根原生质体制备方法可以高效制备狗牙根原生质体，为基于细胞融合和基因转化的狗牙根细胞工程育种和分子生物学研究提供重要材料，具有较大的应用价值。应用价值。应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法。

技术介绍

[0002]狗牙根(Cynodon dactylon L.)是禾本科画眉草亚科狗牙根属的草本植物，是一种重要的暖季型草坪草和牧草，具有生长快、绿期长、耐践踏、耐修剪、耐盐碱、适口性好等诸多优点，在中国南方地区被广泛用于运动场、公园和绿化带的草坪建植以及边坡、荒地的放牧草场建植，具有重要的经济价值。
[0003]除拥有上述优良特性外，狗牙根作为禾本科的野生草种，还具有常异交、染色体倍性复杂的特点，使用传统的杂交育种方法培育狗牙根新品种异常困难。植物细胞去除细胞壁后的原生质体类似动物细胞，易于摄取DNA质粒、病毒、细胞器等外源物质，不仅可用来研究基因的亚细胞定位与表达调控机制，也可以应用于DNA转化、制备融合细胞进行基因工程和细胞工程育种。草坪草、牧草等禾本科植物难以采用农杆菌介导法转基因，因此，在草坪草和牧草育种中原生质体技术尤为重要，是目的基因转化和表达的有效途径。
[0004]目前已有许多植物的原生质体得到成功分离和应用(Yoo SD,Cho YH,Sheen J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc,2007,2:1565
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1572；Trinidad JL,Longkumer T,Kohli A.Rice protoplast isolation and transfection for transient gene expression analysis.Methods Mol Biol,2021,2238:313
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324；Burris KP,Dlugosz EM,Collins AG,Stewart CN Jr,Lenaghan SC.Development of a rapid,low
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cost protoplast transfection system for switchgrass(Panicum virgatum L.).Plant Cell Rep,2016,35:693
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704；Yu G,Cheng Q,Xie Z,Xu B,Huang B,Zhao B.An efficient protocol for perennial ryegrass mesophyll protoplast isolation and transformation,and its application on interaction study between LpNOL and LpNYC1.Plant Methods.2017,13:46；Ren R,Gao J,Yin D,Li K,Lu C,Ahmad S,Wei Y,Jin J,Zhu G,Yang F.Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops.Front Plant Sci,2021,12:626015)。这些所报道的原生质体分离方法均使用了能够促进细胞壁分解的酶对细胞进行处理，使之脱离细胞壁的束缚成为游离的原生质体。但由于不同植物及器官细胞壁的化学成分不同，需要不断尝试才可探索出能够获得特定植物原生质体所合适的酶的组合和浓度范围。酶解液中甘露醇起着至关重要的作用，作为渗透压稳定剂，适宜浓度的甘露醇能够保持原生质体的完整，使其不会膨胀破裂，而不同植物细胞渗透压并不相同，因此不同植物分离原生质体的酶解液所需的甘露醇浓度也是不同的。常用于植物原生质体分离的材料有叶片、愈伤组织、根、表皮和悬浮细胞等，其中叶片具备取材方便、来源广泛等优势，所以成为原生质体分离的最佳材料。相比其他植物，狗牙根原生质体的研究应用非常匮乏。作为一种禾本科的单子叶植物，狗牙根叶片细且长，革质化严重，对其进行操作处理较
为不便，原生质体的制备较常见的双子叶植物存在更多困难(彭小群,唐然,解新明.禾本科植物原生质体分离研究进展.中国农学通报,2015,31(01):252
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257.)。截至目前，有关狗牙根原生质体只有其与匍匐剪股颖原生质体融合的报道(梁雪莲,陈平,佘伟标,黄黉.匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合研究.中国草地学报,2009,31(04):63
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68.)，且文中未详细阐述获得狗牙根原生质体的分离方法。随着狗牙根基因组序列信息的释放，大量狗牙根重要基因的功能特征有待进一步的鉴定。基因功能的解析需要一定的技术体系支撑。建立高效的狗牙根原生质体分离方法不仅能够为狗牙根的细胞工程育种提供基础技术支撑，也将加快狗牙根功能基因组学及后续许多基础研究的进程。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法，并借助绿色荧光蛋白对狗牙根原生质体质粒瞬时转化体系进行验证，旨在成功建立狗牙根叶片原生质体分离系统，弥补狗牙根原生质体制备的空白，为狗牙根功能基因分析和遗传转化等研究提供技术支持。
[0006]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法，包括以下步骤：
[0007](1)从狗牙根植株剪下幼嫩叶片，刮去叶片下表皮后，将叶片撕成长条，置于培养皿中；
[0008](2)在培养皿中加入含纤维素酶和离析酶的酶解缓冲液，抽真空使酶解缓冲液充分浸润叶片；
[0009](3)将含酶解缓冲液和叶片长条的培养皿于黑暗避光环境中室温进行酶解；
[0010](4)将酶解液过滤离心去除上清；
[0011](5)采用洗涤缓冲液洗涤细胞去除残余酶液；
[0012](6)洗涤后的细胞离心后用维持缓冲液重悬获得原生质体细胞，室温避光培养。
[0013]其中，步骤(1)中使用刀片刮去叶片下表皮后，用尖头镊子将叶片撕成宽度为0.4
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0.6mm的长条。
[0014]其中，步骤(2)中酶解缓冲液包括20mM吗啉乙磺酸，0.52M甘露醇，20mM氯化钾，10mM氯化钙，0.1％牛血清白蛋白，pH值为5.7。
[0015]其中，步骤(2)中酶解缓冲液含质量分数2％
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4％纤维素酶和质量分数0.6％
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0.8％离析酶。
[0016]其中，步骤(2)中抽真空时间为60分钟。
[0017]其中，步骤(3)中将含酶解缓冲液和叶片长条的培养皿放置于水平摇床上，于黑暗避光环境中以30
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50转/分钟的低转速晃动酶解缓冲液，室温酶解6
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从狗牙根植株剪下幼嫩叶片，刮去叶片下表皮后，将叶片撕成长条，置于培养皿中；(2)在培养皿中加入含纤维素酶和离析酶的酶解缓冲液，抽真空使酶解缓冲液充分浸润叶片；(3)将含酶解缓冲液和叶片长条的培养皿于黑暗避光环境中室温进行酶解；(4)将酶解液过滤离心去除上清；(5)采用洗涤缓冲液洗涤细胞去除残余酶液；(6)洗涤后的细胞离心后采用维持缓冲液重悬获得原生质体细胞，室温避光培养。2.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤(1)中优选用刀片刮去叶片下表皮后，使用尖头镊子将叶片撕成宽度为0.4
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0.6mm的长条。3.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤(2)中酶解缓冲液配方为20mM吗啉乙磺酸，0.52M甘露醇，20mM氯化钾，10mM氯化钙，0.1％牛血清白蛋白，pH值为5.7。4.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤(2)中酶解缓冲液含质量分数2％
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4％纤维素酶和质量分数0.6％
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0.8％离析酶。5.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤(2)中抽真空时间为60分钟。6.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤(3)中将含酶解缓冲液和叶片长条的培养皿放置于水平...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兵，陈思，徐鑫，束方智，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：