一种利用植物细胞发酵技术生产高丽槐素的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及利用牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素的方法，所述方法在牛大力悬浮细胞放大培养的过程中，加入茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和壳聚糖谷氨酸盐中的两种或两种以上。本发明专利技术克服了现有的牛大力悬浮培养停留在摇瓶水平，细胞产量较低，无法进行规模化培养的缺点，并筛选得到了最优化的促进产物合成的优化培养基和添加工艺，大幅度提升了牛大力高丽槐素的合成速率，为之后更大规模的牛大力细胞悬浮培养提供了新的技术方法。牛大力细胞悬浮培养提供了新的技术方法。

【技术实现步骤摘要】
一种利用植物细胞发酵技术生产高丽槐素的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及利用牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素的方法。

技术介绍

[0002]牛大力，别名金钟根、猪脚笠、倒吊金钟、山莲藕、大力薯。为豆科蝶形花亚科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Milttia specisoa Champ)的干燥根茎。牛大力药用历史悠久，传统中医中以根入药。在《生草药性备要》中已有记载：“壮筋活络，补虚润肺。治腰腿痛，风湿痹痛，慢性肝炎，肺结核”。《陆川本草》也记载其：“清肺止咳，清凉解毒。治咳血，痢疾，温病身热口渴，头晕”。而临床上已证明其对诸多慢性疾病有治疗作用，主治腰痛、肾虚带下、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性肝炎、病后体虚等。
[0003]高丽槐素又称朝鲜槐英、山槐素，天然存在于植物牛大力、高丽槐、红车轴草等植物中，高丽槐素具有很强的抗真菌作用，同时具有抗肿瘤活性，对芳烃羟化酶具有显著抑制作用，可用于参与对高发病肺癌的治疗；对诱导白血病细胞凋亡具有促进作用，对治疗白血病也有一定的辅佐作用；同时该物质对雌激素受体无明显活性，对脂代谢诱导的一氧化氮生成具有抑制作用和强效杀菌作用。
[0004]现有的牛大力高丽槐素的获取方法主要是通过从牛大力中进行提取的方法，但是从牛大力根茎中的提取得率只有0.01％，从根茎中获取要受到地域以及季节的影响。通过植物细胞培养技术生产目的次级代谢产物，是提高天然植物中目标成分含量的有效手段之一。细胞悬浮培养具有繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物细胞培养物的特点。因此，通过植物细胞培养技术培养生产牛大力高丽槐素，能有效提高牛大力高丽槐素的含量和降低生产成本，有利于牛大力高丽槐素的进一步市场化。
[0005]另一方面，在植物次生代谢过程中，诱导物作为一种特殊的生化分子能够快速、专一并有选择地诱导某些特定基因的表达，从而提高代谢途径中相关酶的活性，进而促进或抑制受该酶调控的次生产物的产量。茉莉酸甲酯(MethylJasmonate，MeJA)是激发次生代谢物积累的非生物类诱导因子，不同植物悬浮培养体系中加入茉莉酸甲酯后能够诱导细胞中次生代谢物积累增加。目前尚无以茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和壳聚糖谷氨酸盐处理牛大力悬浮细胞培养体系的报告。
[0006]目前关于牛大力细胞悬浮培养的研究报道较少，且目前的许多研究成果只停留在摇瓶水平，在反应器水平的牛大力细胞悬浮培养一直没有相关报道，而且如何更大限度的促进产物的快速合成一直是悬浮细胞培养需要解决的难题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种牛大力悬浮细胞放大培养的方法，在牛大力细胞的悬浮液体培养过程中，通过添加茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和壳聚糖谷氨酸盐中的两种或两种以上，大幅度促进产物牛大力高丽槐素的合成积累，可以应用于大规模工业化生产工艺。克
服了现有的牛大力悬浮培养停留在摇瓶水平，细胞产量较低，无法进行规模化培养等问题。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和/或壳聚糖谷氨酸盐在牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述苯丙氨酸的添加量为250～1000mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为5～50mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为0.5～10g/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述苯丙氨酸的添加量为450～550mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为15～25mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为1～5g/L。
[0010]本专利技术还提供了利用牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素的诱导剂，包括茉莉酸甲酯、苯丙氨酸或壳聚糖谷氨酸盐中的两种或两者以上的组合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述苯丙氨酸的添加量为250～1000mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为5～50mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为0.5～10g/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述苯丙氨酸的添加量为450～550mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为15～25mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为1～5g/L。
[0011]本专利技术还提供了牛大力悬浮细胞放大培养的方法，在牛大力悬浮细胞放大培养的过程中，添加所述的诱导剂。
[0012]本专利技术还提供了利用牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素的方法，在牛大力悬浮细胞放大培养的过程中，添加所述的诱导剂，获得高丽槐素。
[0013]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述牛大力悬浮细胞放大培养的条件为：20～30℃、通气量100～800L/h、罐压0.01～0.03MPa、转速20～50rpm，培养时间为10～30天。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，添加所述的诱导剂的时间为放大培养的第15～20天。
[0015]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述牛大力悬浮细胞放大培养的条件为：23～28℃、通气量150～600L/h、罐压0.01～0.03MPa、转速25～40rpm，培养时间为15～25天。
[0016]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述牛大力悬浮细胞的制备方法包括如下步骤：
[0017]步骤1：选取牛大力种胚进行消毒处理，消毒后冲洗干净，将种胚切出伤口加入含有激素的固体MS培养基中，所述固体MS培养基成分为MS培养基添加0.2～5mg/L6
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BA，0.5～4mg/L Picloram，10～50g/L蔗糖，5～10g/L琼脂，pH 5.55～5.95，诱导20～30天后选择愈伤组织进行继代培养；所述继代的次数为8～12次；
[0018]步骤2：将所述愈伤组织接入到液体培养基(所述液体培养基即为步骤1所述固体MS培养基除琼脂外的组分，成分及配比完全相同)中，接种量为湿重25～100g/L，在初期培养5～15天内采用摇瓶，将细胞充分打散后采用35目网筛，筛掉大的细胞团，将过滤的小细胞团和单细胞悬液补入液体培养基形成液体悬浮培养体系，继代培养；所述继代的次数为4～6次。
[0019]本专利技术的有益效果包括但不限于：
[0020]1.本专利技术克服了现有的牛大力悬浮培养停留在摇瓶水平，细胞产量较低，无法进行规模化培养的缺点，为之后更大规模的牛大力细胞悬浮培养提供一定的技术方法和基础。
[0021]2.本专利技术通过控制茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和壳聚糖谷氨酸盐的添加量，解决了牛
大力悬浮细胞放大培养中茉莉酸甲酯、苯丙氨酸对牛大力细胞的生长的抑制问题，充分利用茉莉酸甲酯、苯丙氨酸促进牛大力高丽槐素的合成。
[0022]3.本专利技术方法以人工方式调节牛大力悬浮细胞生物量和牛大力高丽槐素的生产过程，有利于产品的质量控制管理。
具体实施方式
[0023]本专利技术公开了利用牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和/或壳聚糖谷氨酸盐在牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量为250～1000mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为5～50mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为0.5～10g/L。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量为450～550mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为15～25mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为1～5g/L。4.利用牛大力悬浮细胞诱导生产高丽槐素的诱导剂，其特征在于，包括茉莉酸甲酯、苯丙氨酸或壳聚糖谷氨酸盐中的两种或两者以上的组合物。5.如权利要求4所述的诱导剂，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量为250～1000mg/L，所述茉莉酸甲酯的添加量为5～50mM，所述壳聚糖谷氨酸盐的添加量为0.5～10g/L。6.如权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡贤能，林良莉，邱云婷，吴佳佳，
申请(专利权)人：海南鑫开源医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：