岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用制造技术

本发明专利技术属于原生质体制备技术领域，具体涉及岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用。本发明专利技术提供了一种原生质体酶解液，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态，并且利用原生质体进行转染时，调整甘露醇浓度，维持细胞渗透压，减少了原生质体在转染过程中的皱缩或涨破，保证了原生质体的细胞形态。利用本发明专利技术所述酶解液能够缩短原生质体制备时的酶解时间，保证了原生质体的高活性和高产量，可用于基因瞬时表达研究。可用于基因瞬时表达研究。可用于基因瞬时表达研究。

【技术实现步骤摘要】
岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用


[0001]本专利技术属于原生质体制备
，具体涉及岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用。

技术介绍

[0002]植物原生质体是指细胞壁以内各种结构的总称，具有再生形成完整植株的能力。目前制备植物原生质体的主要手段是酶解法，然而利用酶解法制备植物原生质体时，如黄瑞华等利用酶解6小时的方法制备穿心莲原生质体(黄瑞华等.穿心莲叶片原生质体制备方法的建立与优化[J/OL].分子植物育种:1
‑
16.http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210428.1414.012.html.)，酶解时间长，制备效率不高。如何缩短制备植物原生质体的时间，是原生质体制备行业亟待解决的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种原生质体酶解液，能够缩短制备原生质体时酶解时间，提高原生质体的制备效率。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶R
‑
10、0.75wt.％离析酶R
‑
10、0.6M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl2和0.1wt.％BSA。
[0006]本专利技术提供了上述酶解液的制备方法，包括如下步骤：
[0007]将所述纤维素酶R
‑
10、离析酶R
‑
10、甘露醇、MES和KCl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；
[0008]将所述第一混合液与CaCl2和BSA混合，过滤除菌得酶解液。
[0009]本专利技术提供了一种穿心莲原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0010]切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片；
[0011]将所述碎片与上述酶解液混合酶解3～4小时，得穿心莲酶解液；
[0012]将所述穿心莲酶解液与W5溶液混合，过滤得原生质体。
[0013]优选的，所述培养的光暗时间比为12h：12h；所述培养的光照强度为100μmol m
‑2s
‑1。
[0014]优选的，所述培养的时间为20～40d；所述培养的温度为20～30℃。
[0015]优选的，所述渗透压调节包括将切碎植物幼苗的下胚轴和叶组织置于渗透压调节液中黑暗培养30min，所述渗透压调节液包括0.6M甘露醇溶液。
[0016]优选的，所述W5溶液包括5mM KCl，154mM NaCl，125mM CaCl2和2mM MES。
[0017]本专利技术提供了一种穿心莲原生质体瞬时转染的方法，包括如下步骤：
[0018]将上述穿心莲原生质体与外源性质粒和PEG溶液混合，黑暗反应12～15min，得反应液；
[0019]混合W5溶液与所述反应液，分离得转染的原生质体。
[0020]优选的，所述外源性质粒、穿心莲原生质体和PEG溶液的体积比为1：10：11。
[0021]优选的，所述外源性质粒含有标记基因。
[0022]本专利技术提供一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶R
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10、0.75wt.％离析酶R
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10、0.6M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl2和0.1wt.％BSA。本专利技术通过精心调配原生质体酶解液，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态。
[0023]进一步的，本专利技术通过调整甘露醇浓度，维持细胞渗透压，减少了原生质体在转染过程中的皱缩或涨破，保证了原生质体的细胞形态。利用本专利技术所述酶解液能够缩短原生质体制备时的酶解时间，保证了原生质体的高活性和高产量，可用于基因瞬时表达研究。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为实施例1穿心莲幼苗期的生长状态图；
[0026]图2为实施例2制备原生质体时采用穿心莲幼苗组织示意图，其中，图2A为完整的组织，图2B为切碎后的组织；
[0027]图3为实施例2制得的原生质体的20倍显微放大图；
[0028]图4为实施例2制得的穿心莲原生质体经过二乙酸荧光素染色后20倍显微放大图；
[0029]图5为实施例2制得的穿心莲原生质体转染pUC
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GFP的成像图，其中图5A为GFP荧光成像结果，图5B为叶绿素(Chl)自发荧光成像结果，图5C为GFP和Chl整合(Merged)，图5D为明场通道(Bright)的成像图。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶R
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10、0.75wt.％离析酶R
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10、0.6M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl2和0.1wt.％BSA。
[0031]本专利技术提供的原生质体酶解液包括1.5wt.％纤维素酶R
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10和0.75wt.％离析酶R
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10。在本专利技术中，所述纤维素酶R
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10和离析酶R
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10混合搭配能够有效分解细胞壁。本专利技术对所述纤维素酶R
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10和离析酶R
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10的来源没有严格要求，优选购自YaKult。
[0032]本专利技术提供的原生质体酶解液包括0.6M甘露醇。本专利技术所述甘露醇维持细胞渗透压。
[0033]本专利技术提供的原生质体酶解液包括20mM MES。本专利技术所述MES发挥缓冲剂的作用。
[0034]本专利技术提供的原生质体酶解液包括20mM KCl和10mM CaCl2。在本专利技术中，所述KCl和CaCl2能够使原生质体不受植物材料生理状态的限制，维持原生质体较好的生理状态，提高原生质体的活性和质量。
[0035]本专利技术提供的原生质体酶解液包括0.1wt.％BSA。本专利技术所述BSA具有保护作用，能够减少或防止细胞壁酶解过程中对细胞器的破坏。
[0036]本专利技术所述原生质体酶解液通过精心调配，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态。
[0037]本专利技术还提供了基于上述技术方案所述酶解液的制备方法，包括如下步骤：
[0038]将所述纤维素酶R
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10、离析酶R
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10、甘露醇、MES和KCl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；
[0039]将所述第一混合液与CaCl2和BSA混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原生质体酶解液，其特征在于，包括1.5wt.％纤维素酶R
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10、0.75wt.％离析酶R
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10、0.6M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl2和0.1wt.％BSA。2.权利要求1所述酶解液的制备方法，包括如下步骤：将所述纤维素酶R
‑
10、离析酶R
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10、甘露醇、MES和KCl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；将所述第一混合液与CaCl2和BSA混合，过滤除菌得酶解液。3.一种穿心莲原生质体的制备方法，包括以下步骤：切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片；将所述碎片与权利要求1所述酶解液混合酶解3～4小时，得穿心莲酶解液；将所述穿心莲酶解液与W5溶液混合，过滤得原生质体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的光暗时间比为12h：12h；所述培养的光照强度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳红磊，周怡宁，王宏斌，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：