用于递送分泌型治疗方式的指环体制造技术

本发明专利技术总体上涉及指环体及其组合物和用途。途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于递送分泌型治疗方式的指环体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年12月12日提交的美国临时申请号62/778,869和2018年12月12日提交的美国临时申请号62/778,866的权益。上述申请的内容通过引用整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年12月9日，名为V2057
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7002WO_SL.txt，并且大小为825,822字节。

技术介绍

[0005]持续需要开发合适的载体以向患者递送治疗性遗传物质。

技术实现思路

[0006]本公开提供了一种指环体(anellosome)，例如合成的指环体，其可用作递送媒介物，例如用于向真核细胞(例如人细胞或人组织)递送遗传材料、用于递送效应子(例如有效负载)，或用于递送治疗剂或治疗效应子(例如，分泌型蛋白质)。可以使用指环体递送的示例性分泌型治疗剂包括例如抗体分子、酶、激素、细胞因子分子、补体抑制剂、生长因子或生长因子抑制剂。
[0007]在一些实施例中，指环体(例如颗粒，例如病毒颗粒，例如指环病毒(Anellovirus)颗粒)包含包封在蛋白质外部的遗传元件(例如，包含治疗性DNA序列的遗传元件)(例如，包含指环病毒衣壳蛋白，例如，指环病毒ORF1蛋白或由指环病毒ORF1核酸编码的多肽的蛋白质外部，例如，如本文所述)，所述蛋白质外部能够将遗传元件引入细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞)。在一些实施例中，指环体是包含蛋白质外部的颗粒，所述蛋白质外部包含由以下编码的多肽：指环病毒的ORF1核酸(例如，甲型细环病毒、乙型细环病毒或丙型细环病毒的ORF1核酸，例如，甲型细环病毒进化分枝1、甲型细环病毒进化分枝2、甲型细环病毒进化分枝3、甲型细环病毒进化分枝4、甲型细环病毒进化分枝5、甲型细环病毒进化分枝6或甲型细环病毒进化分枝7的ORF1，例如如本文所述)。本公开的指环体的遗传元件可以是环状和/或单链DNA分子(例如环状和单链)，并且通常包括与蛋白质外部结合的由所述蛋白质外部封闭的蛋白质结合序列或附接于其上的多肽，其可以促进遗传元件被封闭在蛋白质外部内和/或遗传元件相对于其他核酸在蛋白质外部内富集。在一些情况下，遗传元件是环状或线性的。在一些情况下，遗传元件包含或编码效应子(例如，核酸效应子，例如非编码RNA，或多肽效应子，例如，蛋白质)，例如，所述效应子可以在细胞中表达。在一些实施例中，效应子是治疗剂或治疗效应子(例如，分泌型治疗剂，例如，分泌型多肽)，例如，如本文所述。在一些情况下，效应子例如对于野生型指环病毒或靶细胞是内源性效应子或外源性效应子。在一些实施例中，效应子对于野生型指环病毒或靶细胞是外源的。在一些实施例中，指环体可以通过接触细胞并将编码外效应子的遗传元件引入细胞中而将效应子递送到细胞中，从而效应子由细胞产生或表达。在某些情况下，效应子是内源性效应子(例如，对于靶细胞是
内源的，但例如由指环体以增加的量提供)。在其他情况下，效应子是外源性效应子。在一些情况下，外源性效应子可以调节细胞的功能或调节细胞中靶分子的活性或水平。例如，效应子可以降低细胞中靶蛋白的水平(例如，如实例3和4中所述)。在另一个实例中，指环体可以递送和体内表达效应子，例如外源蛋白质(例如，如实例19和28中所述)。指环体可用于例如将遗传物质递送至靶细胞、组织或受试者；将效应子递送至靶细胞、组织或受试者；或用于治疗疾病和病症，例如通过将可作为治疗剂起作用的效应子递送至所期望细胞、组织或受试者。
[0008]本专利技术进一步提供合成的指环体。合成的指环病毒与野生型病毒(例如，野生型指环病毒，例如本文所述的)相比具有至少一个结构差异，例如相对于野生型病毒的缺失、插入、取代、修饰(例如，酶促修饰)。通常，合成的指环体包括封闭在蛋白质外部内的外源性遗传元件，所述蛋白质外部可用以将遗传元件，或其中编码的效应子(例如，外源性效应子或内源性效应子)(例如，多肽或核酸效应子)递送到真核细胞(例如人细胞)中。在实施例中，指环体不会引起可检测的和/或不想要的免疫或炎症应答，例如不会引起炎症的一种或多种分子标志物(例如，TNF
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α、IL
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6、IL
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12、IFN)增加超过1％、5％、10％、15％，以及不会引起B细胞应答，例如反应性或中和抗体，例如指环体可以对靶细胞、组织或受试者基本上无免疫原性。
[0009]在一方面，本专利技术的特征在于一种指环体，其包含：(i)蛋白质外部；(b)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列(例如DNA序列)和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列)；其中所述外源性效应子包含选自以下的分泌型多肽：抗体分子、酶、激素、细胞因子分子、补体抑制剂、生长因子或生长因子抑制剂，或前述任一项的功能变体；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且其中指环体被配置为将遗传元件递送到真核细胞中。任选地，遗传元件包含相对于野生型指环病毒基因组序列(例如，如本文所述)的至少一个差异(例如，突变、化学修饰或表观遗传改变)，例如插入、取代、修饰(例如酶促修饰)和/或缺失，例如结构域或其部分(例如TATA框、帽位点、转录起始位点、5
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UTR、开放阅读框(ORF)、聚(A)信号或GC富集区中的一个或多个)的缺失。
[0010]在一方面，本专利技术的特征在于一种指环体，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应子(例如内源性或外源性效应子)的序列和蛋白质结合序列(例如，外部蛋白质结合序列，例如包装信号)；以及(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部(例如衣壳)内；并且其中所述指环体能够将所述遗传元件递送到真核(例如，哺乳动物，例如，人)细胞中。在一些实施例中，遗传元件是单链和/或环状DNA。可替代地或组合地，遗传元件具有以下特性中的一种、两种、三种或全部：是环状的，是单链的，它以少于进入细胞的遗传元件的约0.0001％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、或2％频率整合进入细胞的基因组中，和/或它以小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个拷贝/基因组整合进入靶细胞的基因组中。在一些实施例中，整合频率如Wang等人(2004,Gene Therapy[基因疗法]11:711
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721，通过引用整体并入本文)所述确定。在一些实施例中，遗传元件被包封在蛋白质外部内。在一些实施例中，指环体能够将遗传元件递送到真核细胞中。在一些实施例中，遗传元件包含与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如，表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1
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B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个中列出的野生型指环病毒序列)具有至少75％(例如，至少本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成的指环体，所述合成的指环体包含：(I)遗传元件，其包含：(a)启动子元件，(b)编码外源性效应子的核酸序列，其中所述核酸序列与所述启动子元件可操作地连接，并且其中所述外源性效应子是生长激素(例如，hGH)，和(c)5'UTR结构域，其包含SEQ ID NO:54的核苷酸323
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393的核酸序列，或与其至少90％相同的核酸序列；(II)蛋白质外部，其包含由指环病毒ORF1核酸编码的多肽，例如ORF1分子；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且其中所述合成的指环体能够将所述遗传元件递送到人细胞中。2.如权利要求1所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。3.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子由SEQ ID NO:54的核苷酸612
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2612编码。4.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件包含SEQ ID NO:54的核苷酸2868
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2929的核酸序列，或与其具有至少85％序列同一性的核酸序列。5.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含以下中的一种或多种：如表16中所列的精氨酸富集区、胶冻卷结构域、高变结构域、N22结构域和/或C末端结构域的氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。6.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或与其具有至少85％序列同一性的核酸序列。7.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，所述合成的指环体进一步包含含有如表16中所列的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽。8.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件编码如表16中所列的ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。9.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述合成的指环体不包括包含如表16中所列的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽。10.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件不编码如表16中所列的ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。11.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子包含氨基酸序列YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO:829)，其中X
n
各自独立地是任何n个氨基酸的连续序列。12.如权利要求11所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子进一步包含位于氨基酸序列YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO:829)侧翼的第一β链和第二β链，例如，其中所述第一β链包含氨基酸序列YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO:829)的酪氨酸(Y)残基和/或其中所述第二β链包含氨基
酸序列YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO:829)的第二个天冬酰胺(N)残基(从N到C)。13.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述ORF1分子按从N末端到C末端的方向依次包含第一β链、第二β链、第一α螺旋、第三β链、第四β链、第五β链、第二α螺旋、第六β链、第七β链、第八β链和第九β链。14.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件能够通过滚环复制在宿主细胞中扩增，例如产生至少8个拷贝。15.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件是单链的。16.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件是环状的。17.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件是DNA。18.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件是负链DNA。19.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件以少于进入所述细胞的所述指环体的10％、8％、6％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％的频率整合，例如，其中所述合成的指环体是非整合的。20.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件包含表16
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1中所示的共有5
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UTR核酸序列的序列。21.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件包含表16
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2中所示的共有GC富集区的序列。22.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件包含长度为至少100个核苷酸的序列，所述序列的至少70％(例如，约70％
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100％、75％
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95％、80％
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95％、85％
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95％、或85％
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90％)位置由G或C组成。23.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件包含SEQ ID NO:120的核酸序列。24.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述启动子元件对于野生型指环病毒是外源性的。25.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述启动子元件对于野生型指环病毒是内源性的。26.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述遗传元件具有约1.5
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2.0、2.0
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2.5、2.5
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3.0、3.0
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3.5、3.1
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3.6、3.2
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3.7、3.3
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3.8、3.4
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3.9、3.5
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4.0、4.0
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4.5或4.5
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5.0kb的长度。27.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中所述合成的指环体能够感染人体细胞，例如血细胞、皮肤细胞、肌肉细胞、神经细胞、脂肪细胞、内皮细胞、免疫细胞、肝细胞、肺上皮细胞，例如，体外。28.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，所述合成的指环体是基本上非免疫原性的，例如不诱导可检测的和/或不想要的免疫应答，例如根据实例4中所述的方法检测到的。29.如权利要求28所述的合成的指环体，其中所述基本上非免疫原性的指环体在受试者中具有缺乏免疫应答的参考受试者中效力的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的效力。30.如前述权利要求中任一项所述的合成的指环体，其中具有至少1000个所述指环体...

【专利技术属性】
技术研发人员：EG韦因斯坦，A卡韦吉安，S德拉格雷夫，NL尤兹维亚克，KJ莱博，FM迪亚兹，DM纳万达，RD泰德斯通，JD皮茨，
申请(专利权)人：旗舰先锋创新V股份有限公司，
类型：发明
国别省市：