pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种pSFV

【技术实现步骤摘要】
pSFV
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p32病毒样颗粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种pSFV
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p32病毒样颗粒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]ASFV是一种大型的胞内复制病毒，易感细胞为猪单核
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巨噬细胞系，破坏免疫系统引起猪的一种急性、热性、高接触性传染病，即非洲猪瘟。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)在病毒分类中属于DNA病毒目(dsDNA)、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是非洲猪瘟病毒科唯一的成员，病毒粒子呈二十面体对称，平均直径约为200nm。非洲猪瘟临床症状以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为主要特征，目前尚无有效的疫苗用于预防，一经发现只能大规模扑杀，对养猪业造成巨大损失。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求法定报告的动物疫病，我国动物病原微生物名录中将其列为一类动物疫病。病毒粒子结构由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜(分为外层与内层)：核质体主要由病毒基因组、DNA结合蛋白(p10、p14、p37、p34 等)及基因早期转录所需的酶组成；核衣壳主要含有结构蛋白p72和p17，由大约 2000个壳粒组成；内侧囊膜来源于宿主的内质网，结合着p12、p22、p32、p54 及CD2v蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带产物，松散环绕在四周。ASFV基因组为线性双链DNA分子，不同毒株全长大小不一，大致范围在170～193kb，编码 150
‑/>175个蛋白。基因组由中央保守区(约125kb)、两侧可变区(分别为38～48kb、 13～22kb)及基因组末端的反向重复序列(约2.1～2.5kb)组成。本文所研究的p32 蛋白分子量约为30kD。在病毒感染早期表达，能够引起机体产生免疫反应，因此该蛋白具有比较好的抗原性。研究表明，针对p32蛋白的抗体能够抑制病毒内化，说明p32蛋白也参与病毒进入细胞的过程。2018年8月之前我国尚未见非洲猪瘟发病的报道。但政府和研究人员从来没有放松对此病的监控。我国在 2013年就加入全球非洲猪瘟联盟，与世界各国成员共同加强非洲猪瘟的防控工作，开展对ASFV的基础性研究。深入了解机体感染病毒后的免疫反应对ASF 的预防和控制及疫苗研发具有非常重要的意义。近20年来，ASF亚单位疫苗和重组疫苗得到了广泛的研究，多种参与ASFV感染机体的病毒蛋白，如p72、p32、 p54等成为研究的靶蛋白，但是目前研制的亚单位疫苗和重组疫苗仍不能对机体产生足够的保护力，只能在一定程度上降低病毒血症水平，延缓临床症状出现的时间。
[0003]而RNA复制子疫苗是一种基于RNA的复制子、能够进行自主复制的新型疫苗。这种疫苗在胞质中表达,不会和基因组发生整合,具有良好的安全性。 RNA复制子疫苗能够自主复制诱导全身免疫细胞免疫和黏膜免疫，具有高效性、应用范围广等优点而倍受关注。RNA复制子是衍生于RNA病毒基因组并能自主复制的RNA。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒 (Alphavirus),如辛德比斯病毒(Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semlikiforest virus,SFV)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus, VEE)；除甲病毒外，还有黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒、杯状病毒等。表达抗原的RNA复制子可由3种方式递送:(1)体外转录的裸RNA；(2)构建成质粒DNA由细胞
RNA聚合酶Ⅱ体内转录成复制子RNA(基于DNA)；(3)将复制子RNA包装入病毒样颗粒。
[0004]裸RNA存在不稳定、降解快、不易储存等缺点,而病毒样颗粒没有感染性, 作为免疫原,它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,成为良好的疫苗；作为基因治疗载体,可以插入外源蛋白的表位,通过释放外源蛋白达到特异性治疗的目的；由于在细胞表面存在相应受体,既可提高其稳定性还可以增加效率而倍受关注。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种pSFV
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p32病毒样颗粒及其制备方法，通过插入非洲猪瘟p32基因，制得的pSFV
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p32病毒样颗粒能够高效表达外源蛋白p32，有利于非洲猪瘟蛋白的表达筛选和RNA疫苗研制。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题还在于，提供pSFV
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p32病毒样颗粒的应用。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种pSFV
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p32病毒样颗粒的制备方法，包括：
[0008](1)构建得到pSFV
‑
sp6
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p32质粒；
[0009](2)将pSFV
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sp6
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p32、SFV
‑
helper质粒体外转录成mRNA，然后将 pSFV
‑
sp6
‑
p32、SFV
‑
helper质粒体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到 pSFV
‑
p32病毒样颗粒；
[0010]其中，所述pSFV
‑
sp6
‑
p32质粒是通过采用塞姆利基森林病毒为载体，并合成如SEQ ID NO.1所示的ASFV p32基因，然后将所述ASFV p32基因插入所述载体而得。
[0011]作为上述技术方案的改进，步骤(1)包括：
[0012](1.1)合成ASFV p32基因，所述ASFV p32基因的序列为SEQ ID NO.1；
[0013](1.2)设计引物tongyong
‑
F，SP6
‑
p32
‑
R并合成，所述引物tongyong
‑
F的序列为SEQ ID NO.2，所述引物SP6
‑
p32
‑
R的序列为SEQ ID NO.3；
[0014](1.3)用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV
‑
sp6
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EGFP；
[0015](1.4)将基因合成所述ASFV p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；
[0016](1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；
[0017](1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
[0018](1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒；
[0019](1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
[0020]作为上述技术方案的改进，步骤(1.3)中，所述pSFV
‑
sp6
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EGFP由下述方法制得：
[0021]设计与合成引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pSFV
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p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：(1)构建得到pSFV
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sp6
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p32质粒；(2)将pSFV
‑
sp6
‑
p32、SFV
‑
helper质粒体外转录成mRNA，然后将pSFV
‑
sp6
‑
p32、SFV
‑
helper质粒体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFV
‑
p32病毒样颗粒；其中，所述pSFV
‑
sp6
‑
p32质粒是通过采用塞姆利基森林病毒为载体，并合成如SEQ ID NO.1所示的ASFV p32基因，然后将所述ASFV p32基因插入所述载体而得。2.如权利要求1所述的pSFV
‑
p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：(1.1)合成ASFV p32基因，所述ASFV p32基因的序列为SEQ ID NO.1；(1.2)设计引物tongyong
‑
F，SP6
‑
p32
‑
R并合成，所述引物tongyong
‑
F的序列为SEQ ID NO.2，所述引物SP6
‑
p32
‑
R的序列为SEQ ID NO.3；(1.3)用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV
‑
sp6
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EGFP；(1.4)将基因合成所述ASFV p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒；(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。3.如权利要求2所述的pSFV
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p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1.3)中，所述pSFV
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sp6
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EGFP由下述方法制得：设计与合成引物，所述引物包括设计引物Cs
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EGFP
‑
F和Cs
‑
EGFP
‑
R，以及菌液鉴定引物EGFP
‑
鉴定
‑
F和EGFP
‑
鉴定
‑
R：以EGFP
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C1为模板，以Cs
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EGFP
‑
F，Cs
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EGFP
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R为引物扩增Cs
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EGFP片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs
‑
sp6
...

【专利技术属性】
技术研发人员：方倪冉，黄梅，郑航辉，徐婷，杨小云，董楠，
申请(专利权)人：华农肇庆生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：