用于产生病毒融合体的方法和组合物技术

本公开至少部分提供了用于产生融合体的方法和组合物。在一些实施方案中，用于产生融合体的生产细胞包含外源性或过表达的组织蛋白酶分子。在一些实施方案中，这些细胞产生水平增加的活性融合剂，从而导致融合活性融合体的比例更高。的比例更高。的比例更高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生病毒融合体的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月6日提交的美国临时申请63/048,524的优先权，该临时申请的内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
[0003]通过引用并入序列表
[0004]本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为18615_2003540_SeqList.TXT的文件形式提供，所述文件创建于2020年7月1日，大小为97,896字节。序列表电子格式中的信息通过引用整体并入。
[0005]专利技术背景
[0006]复杂的生物制剂是用于多种疾病的有前途的治疗候选物。然而，很难将大的生物制剂递送到细胞中，因为质膜充当细胞与细胞外空间之间的屏障。本领域需要将复杂生物制剂递送到受试者细胞中的新方法。

技术实现思路

[0007]本公开至少部分提供了制备可用于体内递送的融合体(fusosome)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在生产细胞中表达组织蛋白酶分子，以便增加由所述细胞产生的功能性融合体的水平。
[0008]列举的实施方案
[0009]所提供的实施方案是：
[0010]1.一种产生多个融合体的方法，其包括：
[0011](a)提供经修饰的哺乳动物生产细胞，例如人细胞，其包含：
[0012](i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，
[0013](ii)任选的外源性货物分子，例如蛋白质或核酸，和
[0014](iii)亨尼帕病毒(henipavirus)F蛋白分子；和
[0015](iv)亨尼帕病毒G蛋白分子；
[0016](b)在允许产生多个包含所述亨尼帕病毒F蛋白分子和所述亨尼帕病毒G蛋白分子的融合体的条件下，维持(例如，培养)所述经修饰的哺乳动物细胞。
[0017]2.如实施方案1所述的方法，其中所述货物分子包括病毒核酸(例如，慢病毒核酸)。
[0018]3.如实施方案1所述的方法，其中已向所述经修饰的细胞中引入所述外源货物分子(例如，其中已将编码外源货物分子的核酸引入经修饰的细胞)。
[0019]4.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中例如在将组织蛋白酶分子加工为成熟组织蛋白酶形式的条件下，已向所述经修饰的细胞中引入所述组织蛋白酶分子或编码所述组织蛋白酶分子的核酸。
[0020]5.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在适用于组织蛋白酶分子表达的条件下，已向所述经修饰的细胞中引入所述组织蛋白酶分子或编码所述组织蛋白酶分子的核
酸。
[0021]6.一种产生经修饰的哺乳动物生产细胞的方法，所述方法包括：
[0022](i)在增加哺乳动物细胞中组织蛋白酶分子的成熟形式的表达的条件下，向所述哺乳动物细胞中引入编码所述组织蛋白酶分子的核酸分子；
[0023](ii)任选地向所述哺乳动物细胞中引入外源货物分子，例如蛋白质或核酸；
[0024](iii)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒F蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒F蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒F蛋白分子的核酸)；和
[0025](iv)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒G蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒G蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒G蛋白分子的核酸)，
[0026]其中步骤(i)
‑
(iv)可以以任何顺序进行，或者步骤(i)
‑
(iv)中的一个或多个可以同时进行。
[0027]7.一种产生多个融合体的方法，所述方法包括在允许产生多个包含亨尼帕病毒F蛋白分子和亨尼帕病毒G蛋白分子的融合体的条件下，维持(例如，培养)实施方案3a中产生的经修饰的哺乳动物细胞。
[0028]8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括从经修饰的细胞中分离多个融合体中的至少一个。
[0029]9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括：
[0030]a)测定来自所产生的多个融合体的一个或多个融合体，以确定是否满足一个或多个(例如，2个、3个或更多个)标准，其中所述标准选自：
[0031]i)所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；或1:2、3:5、7:10、4:5、9:10或1:11:1；
[0032]ii)所述融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293LX细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量；
[0033]iii)所述融合体例如在活化T细胞(例如原代T细胞，例如Pan
‑
T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测活化T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量；
[0034]iv)其中所产生的多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上的滴度的比率为至少2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、500:1、1000:1、5000:1、10,000:1、50,000:1或100,000:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型；
[0035]v)所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体中的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平高至少10％、20％、30％、40％或50％；
[0036]b)(任选地)如果满足一个或多个标准，则批准所产生的多个融合体或融合体组合物用于释放。
[0037]10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多个融合体具有下列特征中
的1、2、3、4、5、6种或全部7种：
[0038]i)所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；
[0039]ii)所述融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量；
[0040]iii)所述融合体例如在活化T细胞(例如原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生多个融合体的方法，其包括：(a)提供经修饰的哺乳动物生产细胞，例如人细胞，其包含：(i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，(ii)任选的外源性货物分子，例如蛋白质或核酸，和(iii)亨尼帕病毒F蛋白分子；和(iv)亨尼帕病毒G蛋白分子；(b)在允许产生多个包含所述亨尼帕病毒F蛋白分子和所述亨尼帕病毒G蛋白分子的融合体的条件下，维持(例如，培养)所述经修饰的哺乳动物细胞。2.一种产生经修饰的哺乳动物生产细胞的方法，所述方法包括：(i)在增加哺乳动物细胞中组织蛋白酶分子的成熟形式的表达的条件下，向所述哺乳动物细胞中引入编码所述组织蛋白酶分子的核酸分子；(ii)任选地向所述哺乳动物细胞中引入外源货物分子，例如蛋白质或核酸；(iii)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒F蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒F蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒F蛋白分子的核酸)；和(iv)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒G蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒G蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒G蛋白分子的核酸)，其中步骤(i)
‑
(iv)可以以任何顺序进行，或者步骤(i)
‑
(iv)中的一个或多个可以同时进行。3.一种经修饰的哺乳动物细胞，例如人细胞，其包含：(i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，(ii)任选的外源货物分子，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸，和(iii)亨尼帕病毒F蛋白分子；和(iv)任选的亨尼帕病毒G蛋白分子。4.一种融合体，其包含：(a)任选的外源货物，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；(b)活性亨尼帕病毒F蛋白分子，其包含与野生型亨尼帕病毒蛋白F1分子相比具有多达30个连续氨基酸的C端截短的经修饰的F1形式，其中所述融合体中至少33％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。5.一种融合体，其包含：(a)任选的外源货物，例如融合体核酸，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述融合体中至少33％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。6.一种药物组合物，其包含权利要求4或权利要求5所述的融合体和任选的药学上可接受的赋形剂。7.一种将外源货物(例如融合体核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)递送至细胞(例
如，体内或离体)的方法，其包括使所述细胞与多个权利要求4或5中任一项所述的融合体、权利要求6所述的药物组合物或通过权利要求1所述的方法制备的融合体接触。8.一种向受试者递送外源货物(例如融合体核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)的方法，其包括向所述受试者施用有效数量的权利要求4或5中任一项所述的融合体、权利要求6所述的药物组合物或通过权利要求1所述的方法制备的融合体。9.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序。10.如权利要求9所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述内吞基序是基序或所述内吞基序是YSRL基序。11.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。12.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。13.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述升高水平的组织蛋白酶分子包括比相应未经修饰的细胞中内源组织蛋白酶L的量多至少50％或更多的组织蛋白酶分子。14.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞产生的其它方面类似的融合体高至少10％。15....

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：旗舰先锋创新V股份有限公司，
类型：发明
国别省市：