杆状病毒表达系统技术方案

本发明专利技术总体上涉及用于制备指环载体的组合物及其用途。例如，本披露内容提供了用于使用昆虫细胞产生指环病毒蛋白例如ORF1的组合物和方法。物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杆状病毒表达系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月12日提交的美国临时申请号63/038,603和2021年2月8日提交的美国临时申请号63/147,056的权益。上述申请的内容特此通过引用以其全文并入。

技术介绍

[0003]一直需要开发用于制备合适载体的组合物和方法，以将治疗性效应物递送至患者。例如，基于指环病毒的载体是一种有前途的治疗递送方式。然而，难以产生全长纯化的指环病毒ORF1蛋白阻碍了该领域的发展。本领域需要产生纯化的指环病毒蛋白的新方法。

技术实现思路

[0004]本披露内容提供了用于产生指环载体(例如合成的指环载体)的组合物和方法，这些指环载体可以用作递送媒介物，例如，用于将遗传物质、用于将效应物(例如有效载荷)、或者用于将治疗剂或治疗性效应物递送至真核细胞(例如，人类细胞或人类组织)。本文描述了例如杆状病毒颗粒和包含如本文所述的遗传元件区域及适于产生杆状病毒的元件(例如，杆状病毒基因组或其片段)的核酸构建体(在本文中也称作杆粒)，以及适于产生杆状病毒的细胞(例如昆虫细胞)，例如包含这样的核酸构建体的细胞。还描述了包含遗传元件区域和适于将遗传元件区域转移到杆粒骨架中的一个或多个元件(例如，同源重组酶识别位点，例如，Tn7R和Tn7L位点)的供体载体。本文还描述了例如使用这样的核酸构建体(例如，杆粒和/或供体载体)、杆状病毒和/或细胞产生指环载体的方法。此外，本文提供了产生适于产生指环载体的核酸构建体(例如，杆粒和/或供体载体)、杆状病毒和细胞的方法。
>[0005]指环载体(例如，使用如本文所述的组合物或方法产生的指环载体)通常包含封装在蛋白质外壳(例如，包含指环病毒衣壳蛋白例如指环病毒ORF1蛋白或由指环病毒ORF1核酸编码的多肽的蛋白质外壳，例如，如本文所述)中的遗传元件(例如，包含或编码效应物(例如外源性或内源性效应物，如治疗性效应物)的遗传元件)，能够将该遗传元件引入细胞(例如，哺乳动物细胞，如人类细胞)中。在一些实施例中，指环载体是感染性媒介物或颗粒，其包含蛋白质外壳，该蛋白质外壳包含由指环病毒ORF1核酸(例如，甲型细环病毒、乙型细环病毒或丙型细环病毒的ORF1核酸，如甲型细环病毒分支1、甲型细环病毒分支2、甲型细环病毒分支3、甲型细环病毒分支4、甲型细环病毒分支5、甲型细环病毒分支6或甲型细环病毒分支7的ORF1，例如，如本文所述)编码的多肽。本披露内容的指环载体的遗传元件通常是环状和/或单链DNA分子(例如，环状和单链的)，并且通常包括与包封它的蛋白质外壳结合的蛋白结合序列，或与之相连的多肽，这可能有助于将遗传元件包封在蛋白质外壳内，和/或相对于其他核酸而言，将遗传元件富集在蛋白质外壳内。在一些实施例中，指环载体的遗传元件是使用杆状病毒、核酸构建体(例如，杆粒和/或供体载体)和/或昆虫细胞产生的，例如，如本文所述。
[0006]在一些情况下，遗传元件包含或编码效应物(例如，核酸效应物如非编码RNA，或多肽效应物如蛋白质)，例如，可以在细胞中表达的效应物。在一些实施例中，效应物是治疗剂
或治疗性效应物，例如，如本文所述的。在一些实施例中，效应物是内源性效应物或外源性效应物，例如针对野生型指环病毒或靶细胞而言的内源性效应物或外源性效应物。在一些实施例中，效应物针对野生型指环病毒或靶细胞而言是外源性的。在一些实施例中，指环载体可以通过接触细胞并将编码效应物的遗传元件引入细胞中，从而将效应物递送到细胞内，使得效应物由细胞产生或表达。在某些情况下，效应物是内源性效应物(例如，针对靶细胞而言是内源性的，但是，例如由指环载体以更大的量提供的内源性效应物)。在其他情况下，效应物是外源性效应物。在一些情况下，效应物可以调节细胞的功能或者调节细胞中靶分子的活性或水平。例如，效应物可以降低细胞中靶蛋白的水平(例如，如PCT/US19/65995的实例3和4中所述)。在另一实例中，指环载体可以在体内递送和表达效应物，例如外源性蛋白(例如，如PCT/US19/65995的实例19和28中所述)。例如，指环载体可用于将遗传物质递送至靶细胞、组织或受试者；将效应物递送至靶细胞、组织或受试者；或者用于治疗疾病和障碍，例如通过将可作为治疗剂起作用的效应物递送至所期望的细胞、组织或受试者。
[0007]在一些实施例中，本文所述的组合物和方法可用于产生合成指环载体的遗传元件，例如在宿主细胞中。合成指环载体与野生型病毒(例如，野生型指环病毒，例如，如本文所述)相比具有至少一种结构差异，例如，相对于野生型病毒的缺失、插入、置换、修饰(例如，酶促修饰)。一般而言，合成指环载体包括包封在蛋白质外壳内的外源性遗传元件，其可用于将遗传元件或在其中编码的(例如，多肽或核酸效应物)效应物(例如，外源性效应物或内源性效应物)递送至真核(例如，人类)细胞中。在实施例中，指环载体不会造成可检测的和/或不必要的免疫或炎症反应，例如，不会造成一种或多种炎症分子标志如TNF
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α、IL
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6、IL
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12、IFN增加超过1％、5％、10％、15％，以及不会造成B细胞应答，如反应性或中和性抗体，例如，指环载体对靶细胞、组织或受试者是基本上非免疫原性的。
[0008]在一些实施例中，本文所述的组合物和方法可用于产生指环载体的遗传元件，该指环载体包括：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应物(例如内源性或外源性效应物)的序列，和蛋白结合序列(例如，外壳蛋白结合序列，如包装信号)；以及(ii)蛋白质外壳；其中将遗传元件包封在蛋白质外壳(例如，衣壳)内；并且其中指环载体能够将遗传元件递送至真核(例如，哺乳动物，如人类)细胞中。在一些实施例中，遗传元件是单链和/或环状DNA。可替代地或组合地，遗传元件具有以下特性中的一种、两种、三种或全部：是环状的，是单链的，它整合到细胞基因组中的频率低于进入细胞的遗传元件的约0.0001％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％，和/或它以少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个拷贝/基因组整合到靶细胞的基因组中。在一些实施例中，整合频率是通过对从游离载体中分离出来的基因组DNA进行定量凝胶纯化测定来确定的，例如，如Wang等人中所述(2004,Gene Therapy[基因治疗],11:711
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721,其通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，将遗传元件包封在蛋白质外壳内。在一些实施例中，指环载体能够将遗传元件递送到真核细胞中。在一些实施例中，遗传元件包含与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、小细环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如，如本文所述的野生型指环病毒序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核酸序列(例如，300
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，该组合物包含(i)核酸(例如，DNA)构建体，其包含：a)可操作地连接至编码指环病毒ORF分子(例如，ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1和/或ORF1/2分子)的序列的启动子；以及b)适于该核酸构建体在昆虫细胞中复制的骨架区域(例如，杆状病毒骨架区域)，任选地其中该骨架区域还适于该核酸构建体在细菌细胞中复制；以及(ii)包含启动子的指环病毒遗传元件，该启动子可操作地连接至编码外源性效应物的序列。2.一种核酸(例如，DNA)构建体，其包含：a)包含启动子的指环病毒遗传元件，该启动子可操作地连接至编码外源性效应物的序列；以及b)适于该核酸构建体在昆虫细胞中复制的骨架区域(例如，杆状病毒骨架区域)，任选地其中该骨架区域还适于该核酸构建体在细菌细胞中复制。3.一种细菌细胞，其包含如权利要求1或2所述的核酸构建体或核酸制剂。4.一种昆虫细胞，其包含如权利要求1
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3中任一项所述的核酸构建体或核酸制剂。5.一种昆虫细胞，其包含指环病毒ORF1分子，该分子包含指环病毒ORF1精氨酸富集区和指环病毒ORF1 C
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末端结构域。6.一种昆虫细胞，其包含如权利要求2所述的核酸构建体，进一步包含含有如下项的核酸构建体：a)编码指环病毒ORF分子(例如，ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1和/或ORF1/2分子)的序列；以及b)适于该核酸构建体在昆虫细胞中复制的骨架区域(例如，杆状病毒骨架区域)，任选地其中该骨架区域还适于该核酸构建体在细菌细胞中复制。7.一种组合物，该组合物包含分离的指环病毒ORF1分子，该分子包含指环病毒ORF1精氨酸富集区和指环病毒C
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末端结构域，并且不包含可检测水平的指环病毒遗传元件。8.一种组合物，该组合物包含分离的指环病毒ORF1分子，该分子具有至少101kDa的分子量，并且不包含可检测水平的指环病毒遗传元件。9.一种杆状病毒颗粒，其包含如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：旗舰先锋创新V股份有限公司，
类型：发明
国别省市：