用于32种病毒检测的引物组合和扩增子靶向测序方法技术

本发明专利技术公开了一种用于32种病毒检测的引物组合，包括上游引物F1：5

【技术实现步骤摘要】
用于32种病毒检测的引物组合和扩增子靶向测序方法


[0001]本专利技术涉及用于32种病毒检测的引物组合和扩增子靶向测序方法。

技术介绍

[0002]NGS，即下一代测序技术(Next
‑
generation sequencing technology)又称高通量测序技术(High
‑
throughput sequencing)，能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定但读长一般较短。在病原检测中，利用NGS技术可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对，实现感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等多个方面。基于NGS鉴别微生物的主要方法有两种，分别是宏基因组测序(metagenomic NGS，mNGS)和靶向测序(targeted NGS,tNGS)。
[0003]mNGS直接对临床样本中的核酸进行无差别、无选择性的高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的较多病原微生物，能够检测出新发和罕见病原体，它在重症感染领域，特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了难以替代的作用。但mNGS检测结果的灵敏度受宿主及其他微生物背景核酸的影响较大，且成本较高。在组织样本中，人源DNA的含量会在99％以上，这对样本的去除人源背景和测序通量提出来一定的要求。
[0004]相比于mNGS，tNGS是通过(超)多重PCR或杂交捕获的方式检测样本中已知病原微生物，可以提高灵敏及降低测序成本。tNGS检测目标仅包含预先设定的病原体，特异性富集待检靶标基因，因此不会受到人源核酸和背景菌群的影响。通过特异性引物或探针的设计，一次可富集几百到几千个靶标片段，能够实现病毒、细菌和耐药检测单管建库，无需RNA和DNA分别建库。这种方法相比于mNGS测序成本低，对丰度低的病毒和突变检测具有更高的灵敏性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于32种病毒检测的引物组合。
[0006]本专利技术采取的技术方案为：一种用于32种病毒检测的引物组合，包括
[0007]上游引物F1：5
’‑
GAACGACATGGCTACGATCCGACTT special F
‑3’
[0008]下游引物R1：5
’‑
GACCGCTTGGCCTCCGACTT special R
‑3’
，其中special F包括序列表中的Seq
‑1‑
108中的单数序列，special R包括序列表中的Seq
‑1‑
108中的双数序列。
[0009]上述的引物组合还包括：
[0010]随机引物N9：NNNNNNNNN。
[0011]上述的引物组合还包括：
[0012]第二轮扩增上游通用引物
[0013]F2：5
’‑
GAACGACATGGCTACGA
‑3’
(Seq
‑
109)
[0014]第二轮扩增下游BC引物
[0015]R2
‑
MGI_BC：5
’‑
TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGA
‑3’
(Seq
‑
110)，其中NNNNNNNNNN为barcode区域。
[0016]本专利技术还公开了一种用于32种病毒检测的扩增子靶向测序方法，其步骤包括：
[0017](1)合成上述的引物组合；
[0018](2)提取待测样本中的RNA/DNA作为模板，加入上游引物F1、下游引物R1、随机引物N9进行一步RT
‑
PCR法作为第一轮PCR扩增，以富集靶标区域。本次反应同时对DNA和RNA两种类型的核酸进行检测，将RNA的反转录和DNA的扩增在同一个反应内完成，大大简化了操作流程；
[0019](3)第一轮PCR扩增的产物经过磁珠纯化，作为第二轮PCR的模板，加入引物F2和R2
‑
MGI_BC进行第二轮PCR扩增。每个样本的R2
‑
MGI_BC中的barcode区域序列互不相同；
[0020](4)第二轮PCR扩增的产物经磁珠纯化后，通过DNB一步法，使目标序列呈环状扩增，获得文库；
[0021](5)将DNB产物加载到芯片上，进行高通量测序。
[0022]本专利技术的方法可以快速鉴定样本中是否存在32种病毒中的一种或若干种，样本检测限可低至5ng，检测准确率高，在95％以上，无携带污染。
附图说明
[0023]图1为标准品1的扩增文库出库Qsep结果。
[0024]图2为标准品2的扩增文库出库Qsep结果。
[0025]图3为标准品1的下机数据质量。
[0026]图4为标准品2的下机数据质量。
具体实施方式
[0027]为更进一步阐述本专利技术为实现预定专利技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本专利技术的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
[0028]实施例1针对32种病毒的特异性引物设计和合成
[0029]1、针对32种病毒进行引物设计，扩增片段长度在200bp
±
40bp的范围内，以满足纯化操作需求。根据每个检测目标的具体情况，可选择1
‑
2个不重叠的靶向区域，且相距超过500bp，避免产生引物交叉。32种病毒如表1所示，表2是设计的32种病毒的特异引物序列specialF/R。
[0030]2、引物合成
[0031]第一轮PCR扩增的引物：
[0032]上游引物F1：5
’‑
GAACGACATGGCTACGATCCGACTT special F
‑3’
[0033]下游引物R1：5
’‑
GACCGCTTGGCCTCCGACTT special R
‑3’
[0034]随机引物N9：NNNNNNNNN；
[0035]第二轮扩增上游通用引物
[0036]F2：5
’‑
GAACGACATGGCTACGA
‑3’
[0037]第二轮扩增下游BC引物
[0038]R2
‑
MGI_BC：5
’‑
TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGA
‑3’
；
[0039]其中NNNNNNNNNN为barcode区域，barcode区域的设计是每个检测样本采用不同的
序列，以区分不同来源的样本，从而可以同时对多个样本进行测序。
[0040]表1. 32种病毒
[0041][0042][0043]表2.病原特异引物序列
[0044][本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于32种病毒检测的引物组合，包括上游引物F1：5
’‑
GAACGACATGGCTACGATCCGACTT special F
‑3’
下游引物R1：5
’‑
GACCGCTTGGCCTCCGACTT special R
‑3’
，其中special F包括序列表中的序列1
‑
126中的单数序列，special R包括序列表中的序列1
‑
126中的双数序列。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于还包括：随机引物N9：NNNNNNNNN。3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于还包括：第二轮扩增上游通用引物F2：5
’‑
GAACGACATGGCTACGA
‑3’
第二轮扩增下游BC引物R2
‑
MGI_BC：5
’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：易康，顾立江，夏美玲，
申请(专利权)人：南京诺因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：