本发明专利技术涉及一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒。所述试剂盒含有可复合扩增26种猪疫病的引物组合。所述试剂盒的检测范围涵盖了26种猪疫病病原体，包含17种病毒、7种细菌、1种猪支原体和1种猪衣原体。本发明专利技术单管内一次PCR反应即可快速鉴别26种猪疫病，具有检测通量高、灵敏度高、特异性强、成本低和操作简便的特点，为猪疫病的快速、准确检测提供了切实可行的技术方法。实可行的技术方法。
【技术实现步骤摘要】
一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒
[0001]本专利技术涉及核酸检测
，特别涉及一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒。
技术介绍
[0002]生猪养殖是促进农户致富，扩大国内猪肉市场的重要产业。近年来我国猪肉消费需求呈现逐年递增的发展趋势。但在这个过程中，猪疫病一旦发生，若未及时采取有效防治，都会导致病猪死亡，疫病在猪群中传播扩散，必然将给养猪业带来重大的经济损失。病猪是疫病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式，所以做好猪疫病防治工作便显得极为必要。
[0003]目前国内外对于猪疫病的检测方法主要包括免疫学检测和核酸检测方法。免疫学方法主要是检测疫病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。目前大多数实验室经常用到的核酸检测技术方法：等温扩增法和荧光定量RT
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PCR法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。荧光定量RT
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PCR法。等温扩增法存在检测结果稳定性差，一次只能检测单一病原体，无法实现单管多重检测等问题。而荧光定量PCR法，同样存在单管一次最多只能检测4种病原体的低通量问题，增加检测病毒种类，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了增加了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。
[0004]由于引起猪疫病的种类较多，以上技术均具有明显的局限性。所以，本专利技术基于多重PCR技术和毛细管电泳平台，单管一次检测26种猪疫病，可快速、准确地进行猪疫病鉴别，实现早期精准“拔牙”，防止疫病大规模传播。
技术实现思路
[0005]本专利技术目的在于公开了一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
[0006]本专利技术的第一方面在于提供了一套引物组合。所述引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示，能够在同管复合扩增反应中特异性扩增26种猪疫病的基因组序列。26种所述猪疫病包括猪水疱病(SVDV)、非洲猪瘟(ASFV)、口蹄疫病(FMDV)、尼帕病毒性脑炎(NIV)、猪瘟(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪流行性腹泻(PED)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒感染(PPV)、猪伪狂犬病(PRV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪圆环病毒(PCV)、猪流感(SIV)、猪支原体肺炎(MPS)、猪衣原体病(C.suis)、猪塞内卡病毒感染(SVA)、副猪嗜血杆菌病(HPS)、猪丁型冠状病毒感染或猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪丹
毒(SE)、猪链球菌病(Ss)、猪轮状病毒(PoRV)、猪波氏菌病(Bb)、猪副伤寒(Swine paratyphoid)、猪传染性胸膜肺炎(PCP)、猪巨细胞病毒(PCMV)、猪坏死梭杆菌病(Swine Necrobacillosis)。
[0007]本专利技术的第二方面在于提供了所述引物组合在非诊断、治疗为目的的猪疫病检测中的应用所述引物组合既可用于活猪的疾病诊断，也可用于进出口猪肉的检验检疫，有效阻断猪疫病的传播风险，起到保障公共卫生安全的效果。
[0008]本专利技术的第三方面在于提供了一种试剂盒。所述试剂盒中含有上述的引物组合。用户只需一次取样，即可通过引物组合中的26组引物对对样品进行特异性扩增，完成26种猪疫病的筛查，具有高效快捷、准确灵敏的优点。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括由上游引物IC
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F和下游引物IC
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R组成的内标引物对，所述内标引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.53至SEQ ID No.54所示，用于标示试剂盒是否正常工作。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒所含引物如表1所示。
[0011]表1特异性扩增猪疫病的引物
[0012][0013][0014]在本专利技术的一些实施方式中，每组所述引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、Alexa 488、R
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PH或SIZ。通过不同荧光染料的标记，可以将长度相似的扩增产物区分开来，有助于提高复合扩增的目标数量。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，26组所述引物对分为两群。核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.26所示的引物为第一群，检测SVDV、ASFV、FMDV、NIV、CSFV、PRRSV、PED、JEV、PPV、PRV、TGEV、PCV、SIV；甚至可以将IC一并加入所述第一群中。核苷酸序列如SEQ ID No.27至SEQ ID No.52所示的引物为第二群，检测MPS、C.suis、SVA、HPS、PDCoV、SE、Ss、PoRV、Bb、Swine paratyphoid、PCP、PCMV、Swine Necrobacillosis。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一群的所述荧光染料选自Alexa 488，所述第二群的所述荧光染料选自R
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PH。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括P
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Reaction Mix，所述P
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Reaction Mix的组分包括：XT
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Taq酶，终浓度为3U；pH 8.4的Tris
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HCl，终浓度为20Mm；K2SO4，终浓度为30mM；MgCl2，终浓度为0.35mM；dNTPs，终浓度为0.3mM；甘油，终浓度为6％；SBS，终浓度为0.15mg/mL；(NH4)2SO4，终浓度为20mM；PEG，终浓度为6％。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法为：
[0019](1)提取猪的核酸样本
[0020](2)同管复合扩增
[0021]所述试剂盒的反应体系包括P
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Reaction Mix 10μL，引物混合物5μL，阳性标准品或样本核酸提取液5μL，去离子水补足至25μL。所述试剂盒的扩增程序为：95℃预变性2分钟；94℃变性5秒，60℃退火60秒，共29个循环；最后72℃终延伸10分钟
[0022](3)毛细管电泳
[0023]在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.75μL，标品SIZE
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300 0.25μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.引物组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示的26组引物对。2.权利要求1所述引物组合在非诊断、治疗为目的的猪疫病检测中的应用。3.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括由上游引物IC
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F和下游引物IC
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R组成的内标引物对，所述IC
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.53所示，所述IC
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.54所示。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID No.1和所述SEQ ID No.2的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.3和所述SEQ ID No.4的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.5和所述SEQ ID No.6的终浓度为0.11μM，所述SEQ ID No.7和所述SEQ ID No.8的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.9和所述SEQ ID No.10的终浓度为0.14μM，所述SEQ ID No.11和所述SEQ ID No.12的终浓度为0.20μM，所述SEQ ID No.13和所述SEQ ID No.14的终浓度为0.13μM，所述SEQ ID No.15和所述SEQ ID No.16的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.17和所述SEQ ID No.18的终浓度为0.18μM，所述SEQ ID No.19和所述SEQ ID No.20的终浓度为0.23μM，所述SEQ ID No.21和所述SEQ ID No.22的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.23和所述SEQ ID No.24的终浓度为0.16μM，所述SEQ ID No.25和所述SEQ ID No.26的终浓度为0.23μM，所述SEQ ID No.27和所述SEQ ID No.28的终浓度为0.18μM，所述SEQ ID No.29和所述SEQ ID No.30的终浓度为0.09μM，所述SEQ ID No.31和所述SEQ ID No.32的终浓度为0.13μM，所述SEQ ID No.33和所述SEQ ID No.34的终浓度为0.21μM，所述SEQ ID No.35和所述SEQ ID No.36的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：周咏松，汪劲能，梅兴林，李娟，
申请(专利权)人：上海雄图生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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