【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，特别涉及一种跨物种的多个病原体复合扩增体系及检测试剂盒。
技术介绍
1、随着养殖技术的进步，各大畜禽养殖企业的规模在不断扩大，畜禽养殖向着规模化、集约化和标准化的方向发展。同时，各种传染性强、流行面广、危害较大的病原体成为限制畜禽养殖企业发展的主要问题。一旦此类病原体在养殖区爆发，不仅会对畜禽养殖业造成巨大的经济损失，甚至危害到人类健康。近些年来，畜禽疫病检测中出现了越来越多的混合感染情况。除了多种病毒重复感染被同时检出，还出现病毒和高致病性细菌的交叉感染。单一检测技术不能同时检测多种病原体。需要分多次检测，导致操作复杂，费时费力。难以应对综合性疫病爆发的早期检测。而且，部分大型养殖集团既养猪，又养反刍动物和禽类。此类高度集约化的养殖模式，加上病原体感染的复杂性，亟需建立一种新技术，能快速、准确、具体地检测多物种中的多类病原体。
2、目前，动物疫病病原体主要检测方法有以下几种：1、elasia法，基于抗原抗体特异性结合的反应原理，操作简单、方便快速是其突出特点，但其最大的缺点是灵敏性不足，操作复杂，易造成假阳和假阴性结果；2、普通pcr法，可以通过检测特定目标dna或者rna序列来检测单一病原体，具有特异性强、仪器便宜的优点，但扩增产物要通过琼脂糖凝胶电泳进行判读，灵敏度、分辨率较低，耗时长；3、恒温扩增法，不需要复杂的pcr扩增仪器，操作简便，但是灵敏度不高，而且无法多重检测、结果容易出现假阳性；4、荧光定量pcr法，这是目前最常用的检测方法，与普通pcr法相比，扩增产物无需处理，而是通过化
技术实现思路
1、本专利技术目的在于公开了一种跨物种的多个病原体复合扩增体系及检测试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
2、本专利技术第一方面在于提供了一种复合扩增体系。
3、本专利技术第二方面在于提供一种试剂盒。
4、本专利技术第三方面在于提供本专利技术第一方面所述复合扩增体系或本专利技术第二方面所述试剂盒在非疾病检测为目的的动物病原体检测中的应用。
5、本专利技术第一方面所述复合扩增体系包括引物组合和复合扩增pcr mix，所述引物组合靶向扩增38种动物病原体的核酸偏度，所述动物病原体包括猪水疱病病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪肺炎支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、布鲁氏菌、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛生殖道弯曲杆菌、牛传染性胸膜肺炎丝状支原体、小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、禽传染性法氏囊病毒、鸡传染性贫血病毒、禽白血病病毒、鸡白痢沙门氏杆菌、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、禽呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒、禽巴氏杆菌。所述动物病原体的种类是基于农村地区、大型养殖场等容易出现多种动物混居的环境而选择的。经过反复筛选和修改，最终找到能够分别靶向各所述动物病原体中高度保守序列片段并且在复合扩增过程不会互相影响的引物组合，从而实现同管复合扩增38种不同动物病原体的复合扩增体系。
6、在本专利技术第一方面的一些应用实施方式中，所述引物组合的信息如表1所示。
7、表1、38种病原体的引物序列及引物终浓度
8、
9、
10、各引物对采用特定的终浓度还能进一步减轻不同引物之间相互影响的可能性，使得产物能够稳定扩增。
11、在本专利技术第一方面的一些应用实施方式中，所述复合扩增pcr mix组分包括：ph8.1的tris-hcl，浓度为10mm；氯化钾，浓度为100mm；氯化镁，浓度为4.5mm；a型-taq dna聚合酶，浓度为0.25u/μl；xt逆转录酶，浓度为0.5u/μl；四种dntps，浓度分别为0.3mm；海藻糖，浓度为100mm；聚蔗糖，浓度为30mm；单链结合蛋白(single strand dna-bindingprotein，ssd)，浓度为0.1μg/μl。
12、本专利技术第二方面所述试剂盒包含有本专利技术第一方面所述复合扩增体系。
13、在本专利技术第二方面的一些应用实施方式中，各引物对中至少有一条引物的5’末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自fam、a514、tamra、rox、vic、a555、pet、ned、taz、a488、sf488或a568。通过不同的荧光染料，将长度相似的扩增产物数量转化为荧光信号输出，从而实现多种所述动物病原体的核酸复合扩增检测。
14、在本专利技术第二方面的一些应用实施方式中，所述引物组合中核苷酸序列如seq idno:1至seq id no:22所示的引物设为第一色通道，核苷酸序列如seq idno:23至seq idno:44所示的引物设为第二色通道，核苷酸序列如seq id no:45至seq id no:62所示的引物设为第三色通道，核苷酸序列如seq id no:63至seq id no:76所示的引物设为第四色通道，每一色通道选用一种荧光染料，各色通道选用荧光染料互不相同。
15、在本专利技术第二方面的一些应用实施方式中，所述第一色通道选用的所述荧光染料为a488，所述第二色通道选用的所述荧光染料为a514，所述第三色通道选用的所述荧光染料为a555，所述第四色通道选用的所述荧光染料为a568。
16、在本专利技术第二方面的一些应用实施方式中，还包括1个阳性质控品和/或1个阴性质控品，所述阳性质控品为所述动物病原体的检测靶标的质粒混合物，所述阴性质控品为无菌去离子水。使用所述试剂盒进行检测时，通过阳性质控品和阴性质控品进行比对，能够确认检测结果是否可信，是否存在环境和/或样本方面的污染。
17、所述试剂盒使得本领域技术人员获得一种单次检测动物种类及病种多、准确度高、检测速度快、操作简便的动物病原体检测方法，从而克服现有技术中的局限性，满足畜禽养殖企业、动物疫病防控部门及科研院所等单位的需要。
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1.一种复合扩增体系，其特征在于，包括引物组合和复合扩增PCR MIX，所述引物组合靶向扩增38种动物病原体的核酸偏度，所述动物病原体包括猪水疱病病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪肺炎支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、布鲁氏菌、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛生殖道弯曲杆菌、牛传染性胸膜肺炎丝状支原体、小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、禽传染性法氏囊病毒、鸡传染性贫血病毒、禽白血病病毒、鸡白痢沙门氏杆菌、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、禽呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒、禽巴氏杆菌。
2.根据权利要求1所述复合扩增体系，其特征在于，所述引物组合包括：
3.根据权利要求2所述复合扩增体系，其特征在于，所述F1和所述R1的终浓度为0.1μM；所述F2和所述R2的终浓度为0.12μM；所述F3和所述R3的终浓度为0.08
4.根据权利要求1至3任一项所述复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增PCR MIX组分包括：Tris-HCl、氯化钾、氯化镁、Taq DNA聚合酶、XT逆转录酶、dNTPs、海藻糖、聚蔗糖和单链结合蛋白。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述复合扩增体系。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，各引物对中至少有一条引物的5’末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、A514、TAMRA、ROX、VIC、A555、PET、NED、TAZ、A488、SF488或A568。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述引物组合中核苷酸序列如SEQ ID No:1至SEQ ID No:22所示的引物设为第一色通道，核苷酸序列如SEQ IDNo:23至SEQ ID No:44所示的引物设为第二色通道，核苷酸序列如SEQ ID No:45至SEQ ID No:62所示的引物设为第三色通道，核苷酸序列如SEQ ID No:63至SEQ ID No:76所示的引物设为第四色通道，每一色通道选用一种荧光染料，各色通道选用荧光染料互不相同。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述第一色通道选用的所述荧光染料为A488，所述第二色通道选用的所述荧光染料为A514，所述第三色通道选用的所述荧光染料为A555，所述第四色通道选用的所述荧光染料为A568。
9.根据权利要求5至8任一项所述试剂盒，其特征在于，还包括1个阳性质控品和/或1个阴性质控品，所述阳性质控品为所述动物病原体的检测靶标的质粒混合物，所述阴性质控品...
【技术特征摘要】
1.一种复合扩增体系，其特征在于，包括引物组合和复合扩增pcr mix，所述引物组合靶向扩增38种动物病原体的核酸偏度，所述动物病原体包括猪水疱病病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪肺炎支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、布鲁氏菌、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛生殖道弯曲杆菌、牛传染性胸膜肺炎丝状支原体、小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、禽传染性法氏囊病毒、鸡传染性贫血病毒、禽白血病病毒、鸡白痢沙门氏杆菌、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、禽呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒、禽巴氏杆菌。
2.根据权利要求1所述复合扩增体系，其特征在于，所述引物组合包括：
3.根据权利要求2所述复合扩增体系，其特征在于，所述f1和所述r1的终浓度为0.1μm；所述f2和所述r2的终浓度为0.12μm；所述f3和所述r3的终浓度为0.08μm；所述f4和所述r4的终浓度为0.15μm；所述f5和所述r5的终浓度为0.18μm；所述f6和所述r6的终浓度为0.2μm；所述f7和所述r7的终浓度为0.11μm；所述f8和所述r8的终浓度为0.22μm；所述f9和所述r9的终浓度为0.1μm；所述f10和所述r10的终浓度为0.15μm；所述f11和所述r11的终浓度为0.18μm；所述f12和所述r12的终浓度为0.18μm；所述f13和所述r13的终浓度为0.22μm；所述f14和所述r14的终浓度为0.18μm；所述f15和所述r15的终浓度为0.22μm；所述f16和所述r16的终浓度为0.11μm；所述f17和所述r17的终浓度为0.22μm；所述f18和所述r18的终浓度为0.1μm；所述f19和所述r19的终浓度为0.15μm；所述f20和所述r20的终浓度为0.18μm；所述f21和所述r21的终浓度为0.18μm；所述f22和所述r22的终浓度为0.2μm；所述f23和所述r23的终浓度为0.11μm。所述f24和所述r24的终浓度为0.22μm。所述f25和所述r25的终浓度为0.11μm；所述f26和所述r26的终浓度为0.15μm；所述f27和所述r27的终浓度为0.2μm；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪劲能，梅兴林，周咏松，
申请(专利权)人：上海雄图生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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