【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，具体为病原体核酸检测，尤其涉及一种单链dna产物的扩增方法及其应用。
技术介绍
1、基于pcr技术产生单链dna(ssdna)的方法，最初由不对称pcr技术进行ssdna的制备，不对称pcr技术的方法主要有引物浓度不对称pcr、常规热不对称pcr和交错式热不对称pcr。对于linear-after-the-exponential(late-pcr)方法，即指数后线性扩增pcr技术，是不对称聚合酶链式反应的一种高级优化形式，是不对称pcr技术的一种改进，它在不对称pcr技术的基础上，采用不同浓度引物对进行扩增。late-pcr技术具体过程为：限制性引物和过量性引物从指数期开始扩增，其中扩增效率与常规pcr相似；一旦限制性引物耗尽，反应会突然切换到线性扩增，单链产物会继续进行许多额外的热循环，以此高效产生ssdna。目前该pcr技术已经广泛用于病原体核酸检测、基因芯片等生物医学
2、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是一种高效的基因编辑工具，该系统由crispr基因座、cas效应蛋白及向导rna组成。目前crispr-cas系统反式切割性质的发现促使基于该系统的核酸检测技术迅速发展，如2020年诺贝尔化学奖得主jennifer doudna及其团队利用lbcas12a建立了dna内切酶靶向的crispr反式报告检测系统detectr，结合crrna形成复合物，切割具有pam序列且与cr
3、因此可以采用crispr-cas系统中识别dna靶标的技术，利用cas12a蛋白的反式切割活性的特点(对于单链dna靶标的识别可摆脱对pam序列依赖)，通过crispr/cas12a偶联pcr技术来进行单链dna靶标的检测，而且在恒温反应中就可以进行反式活性的切割，切割体系中荧光探针来完成荧光信号检测。
4、但是通过late-pcr技术来进行单链扩增也存在一些问题，其中late-pcr引物设计遵循一定的设计原则如：限制性引物退火温度tml、过量引物退火温度tmx与扩增子退火温度tma满足一下关系才能有较高的扩增效率tml-tmx≥5℃、23℃≥tma-tmx≥13℃，对于病原体特定序列，要满足以上条件进行引物设计较为困难。
5、因此，需要改进以上产生单链dna的pcr扩增技术来实现一种高效、便捷、简易的产生单链靶标、且有效偶联crispr/cas系统进行病原体核酸检测验证的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于为改进late-pcr技术产生单链dna的问题，即对于不同模板的引物设计困难，同时能够达到与late-pcr技术一样高效的单链靶标扩增效率，提出单链dna扩增的新方法，并针对crispr/cas12a识别单链无需pam序列的特性，提供一种基于crispr/cas系统的单链dna检测方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，一种单链dna产物的扩增方法，所述方法具体如下：
4、步骤1，设计通用型单加尾引物：在基因组数据库中筛找一段与检测靶标序列无关的非人类基因组序列，从其序列中查找一段片段作为通用型单加尾引物；所述通用型单加尾引物的序列为：5’-tttttagtttacattgtgc-3’；
5、步骤2，根据病原体核酸序列设计引物对；满足普通pcr引物设计原则，病原体核酸序列引物的上下游引物之间tm值满足δtm≤5℃；
6、步骤3，设计靶标特异性引物：将通用型单加尾引物序列的3’端连接到其中一条病原体核酸序列引物序列的5’端；
7、步骤4，pcr扩增：第一阶段，靶标特异性引物在较高的退火温度条件下进行指数性扩增；第二阶段，当指数扩增结束后，降低退火温度，以通用型单加尾引物进行线性扩增，最后，反应生成单链dna产物；
8、其中，通用型单加尾引物的tm值低于病原体核酸序列引物的tm值，两者tm值差值≥5℃。
9、优选的，所述通用型单加尾引物的序列长度为18-25bp。
10、步骤4中pcr扩增体系为：5u/μl taq酶，0.3μl；2.5mm each dntp，1μl；靶标特异性引物，0.3μl×2；通用型单加尾引物，2μl；10×pcr buffer，2μl；ddh2o，12.1μl；dna模板，2μl；
11、pcr扩增程序：第一阶段：95℃，3min；95℃，10s、65℃，30s，循环30次；第二阶段：72℃，20s；95℃，10s、55℃，15s、72℃，20s，循环20-30次；72℃，4min。
12、本专利技术针对各个病原体靶标的核酸序列设计“单加尾”引物，该“单加尾”序列为一段非人类基因组序列，且与病原体靶序列同源性较差，将该序列简称为通用型单加尾引物，只在靶标的一条引物上加上通用型单加尾引物，以上引物设计原则比late-pcr简单，除满足普通pcr引物设计原则以外，需满足单加尾引物tm值低于病原体核酸序列引物的tm值、单加尾引物的3’端处gc含量较高(即3’端存在3-5个g/c碱基)等设计要点，首先靶标特异性引物进行指数性的第一扩增阶段、再与通用型单加尾引物进行线性的第二扩增阶段来实现单链dna的高效扩增，
13、第二方面，提供单链dna产物的扩增方法在病原体核酸检测中的应用，具体为：利用所述的单链dna产物扩增方法生成单链dna产物，将单链dna产物的扩增方法与crispr/cas系统结合，即将单链dna产物结合cas12a、cr-rna形成复合物，激活反式切割活性，切割荧光产生信号，完成荧光信号检测。
14、基于该单链dna扩增方法，结合crispr-cas系统，建立了一种无需pam序列依赖的病原体核酸检测方法；该检测方法适用于对双链dna序列识别具有pam序列要求，对单链dna序列识别不需要pam序列的crispr/cas系统。
15、本专利技术具有以下技术效果：(1)本专利技术通过在其中一条靶标引物的末端添加通用型单加尾引物，实现基于靶标特异性引物对的指数扩增产生携带有通用序列的双链dna产物，再以通用型引物进行线性扩增，产生单链dna产物；解决传统方法对于单链dna扩增中引物设计难度大、扩增效率低的问题。
16、(2)本专利技术基于该单链dna扩增方法，结合crispr-cas系统，建立了一种无需pam序列依赖的病原体核酸检测方法。解决了crispr-cas系统在进行靶标序列识本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单链DNA产物的扩增方法，其特征在于，所述方法具体如下：
2.根据权利要求1所述的单链DNA产物的扩增方法，其特征在于，所述通用型单加尾引物的序列长度为18-25bp。
3.根据权利要求2所述的单链DNA产物的扩增方法，其特征在于，所述通用型单加尾引物的序列为：5’-TTTTTAGTTTACATTGTGC-3’。
4.根据权利要求1所述的单链DNA产物的扩增方法，其特征在于，步骤4中PCR扩增体系为：5U/μL Taq酶，0.3μL；2.5mM each dNTP，1μL；靶标特异性引物，0.3μL×2；通用型单加尾引物，2μL；10×PCR Buffer，2μL；ddH2O，12.1μL；DNA模板，2μL；
5.权利要求1所述的单链DNA产物的扩增方法在病原体核酸检测中的应用，其特征在于，所述应用具体为：将所述的单链DNA产物扩增方法结合CRISPR/Cas系统，即利用所述的单链DNA产物扩增方法生成单链DNA产物，将单链DNA产物结合Cas12a、Cr-RNA形成复合物，激活反式切割活性，切割荧光产生信号，完成荧光信号
...【技术特征摘要】
1.一种单链dna产物的扩增方法，其特征在于，所述方法具体如下：
2.根据权利要求1所述的单链dna产物的扩增方法，其特征在于，所述通用型单加尾引物的序列长度为18-25bp。
3.根据权利要求2所述的单链dna产物的扩增方法，其特征在于，所述通用型单加尾引物的序列为：5’-tttttagtttacattgtgc-3’。
4.根据权利要求1所述的单链dna产物的扩增方法，其特征在于，步骤4中pcr扩增体系为：5u/μl taq酶，0.3μl；2.5mm eac...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘云龙，尤慧玲，文喻杨，杨帆，顾月清，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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