【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业、渔业、水产养殖、水产养殖病害防控，具体而言，涉及检测ⅱ型鲤疱疹病毒的raa-crispr检测试剂盒。
技术介绍
1、cyhv-2是一种引起鲫和金鱼造血器官坏死病的高致病率、高致死率病毒，鱼受到病毒感染出现症状后24～48h即死亡，严重危害金鱼、鲫养殖业。感染cyhv-2的金鱼和鲫主要病理变化为病鱼体表、下颌和鳃部充血，体内肝脏、脾脏和肾脏肿大出血。《2021中国水生动物卫生状况报告》(农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国农业出版社)数据指出，“全国监测养殖场点282个其中阳性场11个，从阳性样品种类来看，金鱼鲫造血器官坏死病阳性检出率(21.4％)高于鲫阳性检出率(3.0％)，表明观赏鱼养殖场的鲫造血器官坏死病病害不容忽视，应持续重视并加强我国观赏鱼养殖场的健康管理和日常监测”，由于目前还缺乏有效治疗cyhv-2的药物，卫生状况报告同时指出“从苗种源头检验检疫抓起，使检疫覆盖整个养殖过程”，及时对带病苗种进行净化或清除是最有效的病毒防控手段之一。
2、现有的检测方法主要有病原分离与鉴定和核酸检测。病原分离与鉴定方法主要包括细胞分离培养技术，利用敏感细胞系对cyhv-2进行分离，该类型技术由于实验操作流程耗时较长，细胞一次传代通常需要一周，影响疾病诊断的时效性，且对技术人员要求高，需要成本较高的配套仪器和研究平台，通常适用于科研级别的研究类型实验。
3、因此，目前诊断cyhv-2病毒的最普遍采用的是基于核酸扩增的检测方案，包括pcr扩增技术如：普通pcr技术、双重pcr检
4、pcr检测法都是变温反应和需要相应的pcr仪器。常规pcr检测法的过程包括提取dna、加样、pcr反应和凝胶电泳，需要3h(金鱼造血器官坏死病毒检测方法gb/t 36194—2018)，扩增的目标序列长度366bp。荧光定量pcr检测过程包括提取dna、加样、定量pcr反应，需要约1.7h(于力,王津津,史秀杰,郑晓聪,贾鹏,兰文升,刘荭.鲤科疱疹病毒2型taqman实时荧光pcr方法的建立[j].中国动物检疫,2015,32(10):80-84.)。双重pcr检测方法的过程包括提取dna、加样、定量pcr反应，全过程约2.1小时(罗丹鲤疱疹病毒ⅱ型4种检测方法的建立及应用[d].甘肃农业大学,2014.)。
5、lamp和rpa等技术因为不需要变温扩增仪器(如pcr仪器、定量pcr仪器)，同时可以利用颜色反应或恒温扩增仪器(如普通水浴锅、专用恒温扩增仪器等)更适用于农业一线和条件相对简单的基层养殖场开展相应工作。
6、环介导等温扩增(lamp)技术方法，为恒温反应，在63℃恒温条件1.3h内完成反应，直接观察颜色变化；检测标准基因组dna的最低检出限为10copies/μl，检测全过程约2.3小时。
7、重组酶聚合酶扩增(rpa)快速检测方法，提取dna后rpa、反应时间约15min。
8、raa法主要使用3种酶：重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶。重组酶与引物结合形成复合体，在单链dna结合蛋白的辅助下，模板dna解链并使引物与模板配对，然后在dna聚合酶的作用下，生成新的dna链。经过几十个循环后，dna新链的数量以指数级增长。raa法用酶的作用使双链dna解链。因此反应条件较温和，不需要高温使模板dna变性。raa反应的时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段。重组酶介导扩增(raa技术)相较于重组酶聚合酶扩增(rpa技术)的技术改进在于：(1)raa扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物聚合体；rpa使用的重组酶是t4 uvsx，来自于病毒。实验证明，来自于细菌和真菌的重组酶能与dna紧密结合，使核酸体外扩增反应顺利进行。(2)raa使用的聚合酶只具有dna聚合酶活性，反应产物呈指数级增长；rpa的聚合酶具有链置换活性和聚合酶活性，反应产物不呈指数增长。
9、cas12a可用于编辑目标dna。该蛋白最初被称为cpf1，由张锋团队在其2015年的cell论文中首次提出。cas12a(cpf1)是基因编辑酶家族的重要一员，它能够在cas9不能作用的位置切割dna；与crrna以及靶标dna形成三元复合物，该复合物就会表现出很强的反式核酸酶活性活性，可将体系中非靶标单链dna切成几个碱基长度的“碎片”。利用这一特性，doudna教授团队开发出一种被称为“detectr”(dna endonuclease targeted crisprtrans reporter)的诊断系统，该系统由crispr-cas12a(cpf1)和向导rna、荧光报告分子及rpa(recombinase polymerase amplification)等温扩增试剂组成，单管反应即可对临床样本中的少量dna进行快速、简便地即时检测。当加热到一定温度时，rpa扩增目标dna，使cas12a(cpf1)更容易找到并切割它，然后激活cas12a(cpf1)的核酸酶活性使其切割体系中的其它单链dna(也就是荧光报告分子)，从而发出荧光。
10、基于此，期望构建获得一种用于检测ii型鲤疱疹病毒的核酸分子组合物及试剂盒，可实现快速检测，无需依赖于较为复杂的pcr等仪器，并且灵敏度高，特异性好，可以满足现场快速检测。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种多相快速检测ii型鲤疱疹病毒的检测溶液体系、制备方法、检测方法及应用，旨在进一步提升一线临床检疫的效率与准确度。
2、为实现上述目的，第一方面，本专利技术提出了一种多相快速检测ii型鲤疱疹病毒的检测溶液体系，所述检测溶液体系用于检测ii型鲤疱疹病毒，其中，所述检测溶液体包括raa扩增溶液体系以及位于其上层的crispr检测体系，所述raa扩增溶液体系中含有raa扩增试剂和蔗糖，蔗糖初始浓度为10～35wt％，raa扩增溶液体系中还含有下列引物对的其中之一：
3、引物对a：上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示；
4、引物对b：上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物序列如seq id no.4所示；
5、引物对c：上游引物序列如seq id no.5所示，下游引物序列如seq id no.6所示；
6、引物对d：上游引物序列如seq id no.7所示，下游引物序列如seq id no.8所示。
7、在本专利技术所述的技术方案中，检测溶液体系的蔗糖初始浓度为10～35wt％，优选为10～30wt％，更为优选为15～20wt％。
8、需要指出的是，本专利技术首次将传统raa-crispr的分步式检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多相快速检测II型鲤疱疹病毒的检测溶液体系，其特征在于，所述检测溶液体系用于检测II型鲤疱疹病毒，其中，所述检测溶液体包括RAA扩增溶液体系以及位于其上层的CRISPR检测体系，所述RAA扩增溶液体系中含有RAA扩增试剂和蔗糖，蔗糖初始浓度为10～35wt％，所述RAA扩增溶液体系中还含有下列引物对的其中之一：
2.根据权利要求1所述的检测溶液体系，其特征在于，所述RAA扩增溶液体系与CRISPR检测体系的体积比为1：(2～9)。
3.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述RAA扩增溶液体系还含有待测样品。
4.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述RAA扩增试剂含有：
5.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述CRISPR检测体系含有如下试剂的一种或多种：
6.一种制备如权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
7.一种多相快速检测II型鲤疱疹病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用如权利要求1～
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤S3中具体包括如下步骤：
9.如权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系在非诊断目的的应用，其特征在于，所述应用为如下的任一种或多种：
10.一种原料套装组合物，其包含原料套装盒A、原料套装盒B以及其他试剂，其中，所述原料套装盒A含有用于配制权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系中的RAA扩增溶液体系的原料，所述原料套装盒B含有用于配制权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系中的CRISPR检测体系的原料，其他试剂包括引物对A～D中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种多相快速检测ii型鲤疱疹病毒的检测溶液体系，其特征在于，所述检测溶液体系用于检测ii型鲤疱疹病毒，其中，所述检测溶液体包括raa扩增溶液体系以及位于其上层的crispr检测体系，所述raa扩增溶液体系中含有raa扩增试剂和蔗糖，蔗糖初始浓度为10～35wt％，所述raa扩增溶液体系中还含有下列引物对的其中之一：
2.根据权利要求1所述的检测溶液体系，其特征在于，所述raa扩增溶液体系与crispr检测体系的体积比为1：(2～9)。
3.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述raa扩增溶液体系还含有待测样品。
4.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述raa扩增试剂含有：
5.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述crispr检测体系含有如下试剂的一种或多种：
6.一种制备如权利要求1...
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