含有NK细胞的治疗癌症的药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及含有NK细胞的治疗癌症的药物组合物。本发明专利技术通过针对TNF

【技术实现步骤摘要】
含有NK细胞的治疗癌症的药物组合物


[0001]本专利技术涉及生物领域，更具体涉及转基因的NK细胞在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。

技术介绍

[0002]NK细胞是具有多种免疫学功能的淋巴样细胞。人类NK细胞为CD56和CD16阳性.CD3、CIM和CD19为阴性。少部分NK细胞可以为CD8阳性。小鼠NK细胞为NK1.1和ASGM1阳性，CD3、CIM和cr18为阴性NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过Fas配基。NK细胞可以产生TNF
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a、IFN
‑
γ和IL
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1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位。NK细胞具有对异体骨髓快速排异的能力，但并不介导实体组织的移植排异。
[0003]NK细胞具有杀伤细胞活化受体(killeractivatoryreceptor，KAR)、杀伤细胞抑制受体(killerinhibitoryreceptor，KIR)、杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin
‑
likereceptors，KLR)和Fcγ受体(CD16)共4种受体，前3种受体可抑制或激活NK细胞，使之识别自身组织细胞与体内异常组织细胞的能力，第4种受体主要识别NK细胞表面的IgG1和IgG3标志物，介导NK细胞识别被抗体包被的靶细胞，从而发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibodydependentcell
‑
mediatedcytotoxicity，ADCC)，进而杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤。NK细胞具有较广的抗瘤谱，可杀伤同系、同种或异种肿瘤细胞，其杀伤靶细胞的机制可能有:
①
释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡。
②
通过死亡受体调节诱导靶细胞凋亡。
③
分泌多种效应性细胞因子对抗转移肿瘤。
④
激发继发肿瘤免疫效应。
[0004]NK细胞可以被IL
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2、IL
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12、IL
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15等所活化.其中IL
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15和Fh
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3配基在NK细胞分化中尤为重要。活化的NK细胞产生大量的细胞因子，包括IL
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1、TNF
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a、IFNG
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CSF和GM
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CSF。这些细胞因子极有可能参与造血的正负调节。当活化NK细胞转输体内，小鼠同基因骨髓移植的造血恢复过程明显加快，尤其是粒细胞和血小板的恢复加快，显示出一定的应用前景。
[0005]研究表明细胞因子基因修饰可增强NK细胞功能。细胞因子IL
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12可增强NK细胞的增殖能力和效应功能Goding等利用小鼠IL
‑
12基因来修饰依赖IL
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2活化的鼠原代NK细胞，从而减少对外源性IL
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2的需求。该研究利用一种腺病毒载体实现GFP/荧光素酶/β
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gal和mlL
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12基因的瞬时过表达，可使得高达80％的细胞表达绿色荧光蛋白，在转入48h后，这些细胞中IL
‑
12的分泌量到达峰值，而紧接下来由于腺病毒载体表达的短暂性，其水平下降。这项研究同时表明，在接受外源性IL
‑
2注射的同时，利用表达mlL
‑
12的NK细胞治疗B16肺转移瘤小鼠，可显著提高其生存期，这与mlL
‑
12
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NK细胞功能的增强以及在肿瘤组织的积累有关。另有研究表明，过继转输mlL
‑
12修饰的NK细胞能进一步增强未修饰NK细胞的功能，说明NK细胞分泌IL.12可以激活邻近的细胞，导致周围的免疫细胞活化，从而提高免疫应答。
[0006]干细胞因子(SCF)联合IL
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2、IL
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15可以显著提高NK细胞的增殖能力并促进其进化Zhang等采用脂质体将SCF载体转染入NK
‑
92细胞，在IL
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2或IL
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l5存在条件下进行培养，其
增殖能力显著增强；在同样的培养条件下，与未修饰的对照组相比，SCF修饰的NK
‑
92细胞对多种肿瘤细胞的杀伤能力显著增强。这可能与杀伤相关分子的表达升高有关，如穿孔素和FasL等。这种基因修饰方式对NK细胞的表型及其分泌IFN的能力并没有显著影响，但是低剂量IL
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2时，NK
‑
92
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SCF细胞应答相对较弱。因此在临床上，利用SCF修饰的NK细胞进行治疗时，仍然依赖IL
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2的存在。
[0007]但是，目前研究发现在野生的SCF活性仍然提高的空间，而且提高NK细胞增殖以及自活化效率是目前研究的重点方向。

技术实现思路

[0008]本专利技术克服现有技术的缺陷，提供了一种改进的转基因NK细胞及其用于癌症的用途。
[0009]本专利技术提供了表达TNF
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α的经修饰的NK细胞。
[0010]任选的，修饰的NK细胞还表达IL
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15。
[0011]任选的，所述NK细胞还可以为NK
‑
92细胞。
[0012]更进一步的，将SEQ ID NO：3所示的IL
‑
15采用T2A连接子与89V/H突变的SEQ ID NO：2的氨基酸序列融合后得到的SEQ ID NO：5的基因表达到NK细胞中。
[0013]更进一步的，所述TNF
‑
α为突变的蛋白，所述突变对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的89V/H，即第89位的V突变为H。所述突变是根据生物信息学分析肿瘤坏死因子的生物学特点，在结构分析上发现该因子含有死亡结构域，形成一种类似于螺旋
‑
环
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螺旋的结构与TNFR1的胞内死亡结构域相互作用。在保证TNF
‑
α三维结合活性条件下，设计了多处对活性有提高预期的突变位点，通过鉴定后获得的突变，所述突变是通过碱性氨基酸侧链常含有可质子化的碱性化学基团来增加极性效果进而促进结合速度和结合效果。
[0014]更进一步的，在SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在89V/H突变的基础上，还可以进行保守取代。其中一个类别的氨基酸被另一个相同类别的氨基酸取代，落在所公开的变体的范围内，只要该取代实质上不改变多肽的活性。保守取代对于本领域技术人员是众所周知的。
[0015]在一些实施方案中，用于转化NK细胞的构建体的序列被密码子优化，以使基因在系统中的表达效率最大化。密码子优化通常通过用在表达系统的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因的NK细胞在制备用于癌症治疗的药物组合物中的用途；其中，所述基因为融合基因，即将SEQ ID NO：3所示的IL
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15采用T2A连接子与89V/H突变的SEQ ID NO：2的TNF
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α氨基酸序列融合，所述融合基因的序列如SEQ ID No：5所示。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述NK细胞为NK
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92细胞。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述癌症是乳腺癌。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张克礼，顾超，
申请(专利权)人：北京创世客生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：