用于治疗达农病的基因治疗载体制造技术

本公开提供了基因治疗载体，其包含编码LAMP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗达农病的基因治疗载体
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2019年11月13日提交的美国临时专利申请号62/934,928、2019年2月12日提交的美国临时专利申请号62/804,521的优先权，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请正通过EFS
‑
Web以电子方式提交，并且包括以电子方式提交的.txt格式的序列表。.txt文件包含于2020年2月11日创建的名为“ROPA_013_02WO_ST25.txt”的序列表，其大小为～61千字节。所述.txt文件中所含的序列表是说明书的部分，并且以全文引用的方式并入本文。


[0005]本专利技术大体上涉及与溶酶体相关膜蛋白2(LAMP
‑
2，也称为CD107b)中的突变相关的疾病的基因疗法。

技术介绍

[0006]溶酶体相关膜蛋白2(LAMP
‑
2，也称为CD107b)是编码溶酶体相关膜糖蛋白的基因。基因的替代剪接产生三种同种型：LAMP
‑
2A、LAMP
‑
2B和LAMP
‑
2C。LAMP
‑
2中的功能缺失型突变与人类疾病相关，包括达农病(Danon disease)(一种与自噬功能受损相关的家族性心肌病)。达农病是一种罕见但严重的心脏和骨骼肌病，由于心律失常和心肌病导致了严重的发病率和早期死亡率。遗传的X连锁性质解释了男性与女性之间的表型严重程度的所报告差异。Boucek等人Genetics in Medicine 13:563
‑
568(2011)。现在应当理解，所述疾病是由溶酶体相关膜蛋白
‑
2(LAMP
‑
2)的原发性缺乏引起的，所述溶酶体相关膜蛋白在伴侣介导的自噬中充当溶酶体膜受体。Nishino等人Nature 406:906
‑
910(2000)。

技术实现思路

[0007]本公开提供了与LAMP2、其使用方法、药物组合物等有关的此类基因治疗载体。尽管已知腺相关病毒(AAV)载体的临床用途，但选择用于基因疗法的AAV的优选血清型仍然具有挑战性和不可预测。
[0008]本公开提供了包含编码LAMP
‑
2多肽的多核苷酸序列的改进的基因治疗载体、其使用方法、药物组合物等。特别地，本公开提供了重组AAV载体，其具有表达LAMP
‑
2A、LAMP
‑
2B或LAMP
‑
2C的AAVrh74血清型，以用作例如达农病的治疗剂。
[0009]本专利技术的其他特征和优点将从以下详细描述和权利要求中显而易见且被其涵盖。
附图说明
[0010]图1描绘了具有AAVrh74血清型的AAV载体的实施方案。
[0011]图2显示了通过qPCR在受达农病影响最大的器官中进行载体DNA定量的柱状图。
[0012]图3A显示了通过qPCR在心脏区域中进行载体DNA定量的柱状图。
[0013]图3B显示了通过qPCR在肌肉中进行载体DNA定量的柱状图。
[0014]图4显示了通过RT
‑
qPCR在受达农病影响最大的器官中进行mRNA定量的柱状图。
[0015]图5A显示了通过RT
‑
qPCR在心脏区域中进行mRNA定量的柱状图。
[0016]图5B显示了通过RT
‑
qPCR在肌肉中进行mRNA定量的柱状图。
[0017]图6A示出了在未经治疗的左心室中通过RNAscope进行半定量mRNA分析的显微照片。
[0018]图6B示出了在经治疗的左心室中通过RNAscope进行半定量mRNA分析的显微照片。
[0019]图7A示出了在未经治疗的股四头肌中通过RNAscope进行半定量mRNA分析的显微照片。
[0020]图7B示出了在经治疗的股四头肌中通过RNAscope进行半定量mRNA分析的显微照片。
[0021]图8示出了在经治疗的腓肠肌中通过RNAscope进行半定量mRNA分析的显微照片。
[0022]图9显示了通过ELISA在受达农病影响最大的器官中进行蛋白质定量的柱状图。
[0023]图10A显示了通过ELISA在心脏区域中进行蛋白质定量的柱状图。
[0024]图10B显示了通过ELISA在肌肉中进行蛋白质定量的柱状图。
[0025]图11A
‑
11D示出了在研究过程中NHP血清中临床病理学测量的线图。将临床病理学水平评估为研究期间以下各项的变化：(图11A)丙氨酸氨基转移酶，ALT；(图11B)天冬氨酸氨基转移酶，AST；(图11C)白细胞，WBC；(图11D)中性粒细胞。
具体实施方式
[0026]本公开提供了基于AAVrh74的基因治疗载体，其采用优化表达盒来递送编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)蛋白(也称为CD107b)中的一种的多核苷酸。通常，LAMP2是人类LAMP2，但设想了任何哺乳动物LAMP
‑
2的表达。天然LAMP2基因通过替代剪接三种变体来编码：LAMP
‑
2A、LAMP
‑
2B和LAMP
‑
2C。LAMP
‑
2B与达农病相关。尽管本公开主要涉及达农病，但LAMP2涉及各种其他疾病，包括癌症。所公开的载体可用于治疗这些疾病中的任一种。
[0027]本公开还涉及AAVrh74衣壳或与AAVrh74衣壳具有实质性同源性并保留AAVrh74衣壳的功能的衣壳。本公开提供了表1中列出的序列。表1还提供了用于各种实施方案的多核苷酸序列。所述序列并不意图限制本专利技术，因为设想了用不同启动子、增强子或其他遗传元件取代或修饰这些序列。
[0028]表1：序列
[0029][0030][0031]本公开提供了重组腺相关病毒(rAAV)基因治疗载体。如本文所用，“rAAV基因治疗载体”是指包括核酸和蛋白质组分，包括衣壳蛋白的完整病毒。在一些实施方案中，衣壳蛋白由与转移质粒反式连接的质粒上提供的多核苷酸编码。野生型AAVrh74cap的多核苷酸序列如下：
[0032]AAVrh74衣壳编码序列(SEQ ID NO:1)
[0033]ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACAACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组腺相关病毒(rAAV)基因治疗载体，其包含多核苷酸和衣壳蛋白，其中所述多核苷酸包含5'ITR、表达盒和3'ITR，其中所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP
‑
2)或其功能变体的转基因，其中所述表达盒侧接所述5
’
ITR和所述3
’
ITR，并且其中所述衣壳蛋白包含AAVrh.74衣壳蛋白或其功能变体。2.如权利要求1所述的rAAV基因治疗载体，其中所述LAMP
‑
2选自LAMP
‑
2A、LAMP
‑
2B和LAMP
‑
2C。3.如权利要求1所述的rAAV基因治疗载体，其中所述衣壳蛋白与选自SEQ ID NO:2
‑
4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。4.如权利要求3所述的rAAV基因治疗载体，其中所述衣壳蛋白与SEQ ID NO:2享有至少95％序列同一性。5.如权利要求4所述的rAAV基因治疗载体，其中所述衣壳蛋白与SEQ ID NO:2享有至少97％序列同一性。6.如权利要求5所述的rAAV基因治疗载体，其中所述衣壳蛋白与SEQ ID NO:2享有至少99％序列同一性。7.如权利要求1至6中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述衣壳蛋白是AAVrh.74衣壳蛋白。8.如权利要求1至7中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述5'ITR和所述3'ITR各自分别是AAV2的5'ITR和AAV2的3'ITR，或其变体。9.如权利要求8所述的rAAV基因治疗载体，其中所述5'ITR与SEQ ID NO:13享有至少98％同一性，并且所述3'ITR与SEQ ID NO:14享有至少98％同一性。10.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述转基因被密码子优化以在人类宿主细胞中表达。11.如权利要求1至10中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒含有比SEQ ID:6少的CpG位点。12.如权利要求1至11中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒含有比SEQ ID:6少的隐蔽剪接位点。13.如权利要求1至12中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒编码比SEQ ID:6少的替代开放阅读框。14.如权利要求1至13中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述转基因与选自SEQ ID NO:7
‑
9的序列享有至少95％同一性。15.如权利要求14所述的rAAV基因治疗载体，其中所述转基因与选自SEQ ID NO:7
‑
9的序列享有至少99％同一性。16.如权利要求15所述的rAAV基因治疗载体，其中所述转基因包含选自SEQ ID NO:7
‑
9的序列。17.如权利要求1至16中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒包含可操作地连接至所述转基因的共有最优Kozak序列，其中所述共有最优Kozak序列包含SEQ ID NO:20。18.如权利要求1至17中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒包含可操作
地连接至所述转基因的全长polyA序列，其中所述全长polyA序列包含SEQ ID NO:26。19.如权利要求1至18中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒在所述转基因的起始密码子的5'侧不包含起始密码子。20.如权利要求1至19中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒包含按5
’
至3
’
方向可操作地连接的第一反向末端重复序列、增强子/启动子区、内含子、共有最优Kozak序列、所述转基因、包括全长polyA序列的3
’
非翻译区，以及第二反向末端重复序列，其中所述表达盒在所述转基因的起始密码子的5'侧不包含起始密码子。21.如权利要求20所述的rAAV基因治疗载体，其中所述增强子/启动子区按5'至3'方向包含CMVIE增强子和鸡β
‑
肌动蛋白启动子，并且任选地其中所述增强子/启动子区还包含鸡β
‑
肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及兔β
‑
珠蛋白基因的剪接受体。22.如权利要求20所述的rAAV基因治疗载体，其中所述增强子/启动子区包含能够介导与肝组织相比在心脏组织和/或骨骼肌组织中增加的表达的组织特异性启动子。23.如权利要求1至21中任一项所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒与选自SEQ ID NO:10
‑
12的序列享有至少95％同一性。24.如权利要求23所述的rAAV基因治疗载体，其中所述表达盒包含选自SEQ ID NO:10
‑
12的序列。25.一种药物组合物，其包含如权利要求1至24中任一项所述的rAAV基因治疗载体。26.一种治疗或预防有需要的受试者的达农病或另一种自噬障碍的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1至24中任一项所述的rAAV基因治疗载体或如权利要求25所述的药物组合物。27.如权利要求26所述的方法，其中所述rAAV基因治疗载体或药物组合物经由选自由以下组成的组的途径施用：静脉内、动脉内、心脏内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外和肌内。28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述自噬障碍选自由以下组成的组：终末期心力衰竭、心肌梗塞、药物毒性、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老。29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述受试者表现出达农病或另一种自噬障碍的症状。31.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为具有减少的或不可检测的内源性LAMP
‑
2表达。32.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定为具有突变的LAMP
‑
2基因。33.如权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述rAAV基因治疗载体以约3
×
10
12
vg/kg至约3
×
10
14
vg/kg的剂量施用。34.如权利要求26至33中任一项所述的方法，其中所述rAAV基因治疗载体以约3
×
10
12
vg/kg至约1.2
×
10
13
vg/kg的剂量施用。35.如权利要求26至...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：太空飞船七有限责任公司，
类型：发明
国别省市：