用于婴儿恶性骨硬化病的基因治疗载体制造技术

本公开提供了包含编码TCIRG1多肽或其功能性变体的多核苷酸序列的改进的基因治疗载体、其使用方法、药物组合物等。具体地，本公开提供用于治疗婴儿恶性骨硬化病(IMO)的慢病毒载体。载体。载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于婴儿恶性骨硬化病的基因治疗载体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年5月23日提交的美国临时申请序列号62/852,216的优先权益，该申请的内容通过引用整体并入本文。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与本申请相关的序列表以文本格式提供，而不是纸质副本，并在此通过引用并入说明书中。包含所述序列表的文本文件名称是ROPA_003_01WO_ST25.txt。所述文本文件大约62KB，创建于2020年5月22日，正在通过EFS
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Web以电子方式提交。


[0005]本公开总体涉及与T细胞免疫调节因子1，即ATPase H+转运V0亚基a3基因(TCIRG1)突变相关疾病的基因治疗。具体地，本公开提供了包括编码TCIRG1蛋白(TCIRG1)的表达盒的基因治疗载体和质粒。

技术介绍

[0006]婴儿恶性骨硬化病(IMO)是一种罕见的隐性遗传病，其特征是由功能失调的破骨细胞造成的骨量增加。该病最常见的原因是T细胞免疫调节因子1，即ATPase H+转运V0亚基a3基因(TCIRG1)的突变。TCIRG1涉及破骨细胞的骨吸收能力。
[0007]破骨细胞功能可以通过慢病毒载体介导的TCIRG1表达恢复。Moscatelli等人Bone 57:1
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9(2013).进一步的研究表明，尽管由具有组成型生理启动子的慢病毒载体表达，但TCIRG1的慢病毒介导的表达以与内源性基因产物相同的方式受到调控。Thudium等人Calcif Tissue Int.99:638
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648(2016).此外，他们确定，与所述基因的密码子优化的cDNA相比，即使其mRNA水平要高得多，而天然TCIRG1基因序列导致破骨细胞中蛋白质表达和功能性拯救的水平更高。此外，数据显示仅需要一小部分具有功能性TCIRG1的人类前破骨细胞即可显著增强体外再吸收功能，这可能是由于融合了再吸收破骨细胞和非再吸收破骨细胞，与之前oc/oc鼠骨硬化病模型的结果一致。从疗效和安全性的角度来看，这些发现对进一步开展骨硬化病的基因治疗，令人鼓舞。
[0008]本领域仍然需要TCIRG1的基因治疗载体和使用这种载体的治疗方法。此外，需要产生此类基因治疗载体的可靠方法。本公开提供了此种基因治疗载体、其制造方法、其使用方法、药物组合物等。

技术实现思路

[0009]本公开提供了包含编码TCIRG1多肽或其功能性变体的多核苷酸序列的改进的基因治疗载体、其使用方法、药物组合物等。
[0010]一方面，本公开提供了包含表达盒的转移质粒，所述表达盒包含编码T细胞免疫调节因子1(TCIRG1)或其功能性变体的同源异构体的编码多核苷酸，以及启动子，其中所述多核苷酸可操作地连接至所述启动子，并且其中所述转移质粒包含RNA
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OUT阻遏物和CMV IE
启动子。
[0011]在一些实施方案中，所述RNA
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OUT阻遏物与SEQ ID NO:32具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。
[0012]在一些实施方案中，所述CMV IE启动子与SEQ ID NO:33具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。
[0013]在一些实施方案中，所述转移质粒包含pCCL骨架。
[0014]在一些实施方案中，所述pCCL骨架包含所述RNA
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OUT阻遏物。
[0015]在一些实施方案中，所述转移质粒与SEQ ID NO:39具有至少95％的同一性。
[0016]在一些实施方案中，所述转移质粒包含SEQ ID NO:39。
[0017]在一些实施方案中，所述启动子为EFS启动子。
[0018]在一些实施方案中，所述EFS启动子与SEQ ID NO:2具有至少95％的同一性。
[0019]在一些实施方案中，所述EFS启动子为SEQ ID NO:2。
[0020]在一些实施方案中，所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少95％的同一性。
[0021]在一些实施方案中，所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少99％的同一性。
[0022]在一些实施方案中，所述编码多核苷酸为SEQ ID NO:3。
[0023]在一些实施方案中，所述表达盒包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。
[0024]在一些实施方案中，所述WPRE是SEQ ID NO:4。
[0025]在一些实施方案中，所述表达盒与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。
[0026]在一些实施方案中，所述表达盒的两侧是5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR。
[0027]在一些实施方案中，所述5'LTR是SEQ ID NO:34和/或所述3'LTR是SEQ ID NO:28。
[0028]在一些实施方案中，所述表达盒与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。
[0029]在一些实施方案中，所述表达盒是SEQ ID NO:1。
[0030]另一方面，本公开提供了一种表达盒，包含编码T细胞免疫调节因子1(TCIRG1)或其功能性变体的同源异构体的多核苷酸，和EFS启动子，其中可选地所述多核苷酸可操作地连接到所述EFS启动子。
[0031]在一些实施方案中，所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少99％的同一性。在一些实施方案中，所述编码多核苷酸为SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述EFS启动子与SEQ ID NO:2具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述EFS启动子为SEQ ID NO:2。
[0032]在一些实施方案中，所述表达盒包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，所述WPRE是SEQ ID NO:4。
[0033]在一些实施方案中，所述表达盒与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述表达盒为SEQ ID NO:1。
[0034]另一方面，本公开提供了一种重组慢病毒基因组，包括按5'到3'的顺序，慢病毒5'长末端重复序列(LTR)；本文公开的表达盒；和慢病毒3'LTR，其中所述重组慢病毒基因组不能复制。
[0035]另一方面，本公开提供了一种慢病毒颗粒，包含此种重组慢病毒基因组。
[0036]另一方面，本公开提供了一种转移质粒，包含此种重组慢病毒基因组。在某些实施
方案中，所述转移质粒包含RNA
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OUT序列。在一些实施方案中，所述RNA
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OUT序列为SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，所述RNA
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OUT序列被配置为使得所述转移质粒能够在包装细胞系中稳定增殖。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种转移质粒，包含表达盒，所述表达盒包含编码T细胞免疫调节因子1(TCIRG1)或其功能性变体的同源异构体的编码多核苷酸和启动子，其中所述多核苷酸可操作地连接到所述启动子，并且其中所述转移质粒包含RNA
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OUT阻遏物和CMV IE启动子。2.根据权利要求1所述的转移质粒，其中所述RNA
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OUT阻遏物与SEQ ID NO:32具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。3.根据权利要求1或权利要求2所述的转移质粒，其中所述CMV IE启动子与SEQ ID NO:33具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的转移质粒，其中所述转移质粒包含pCCL骨架。5.根据权利要求4所述的转移质粒，其中所述pCCL骨架包含所述RNA
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OUT阻遏物。6.根据权利要求5所述的转移质粒，其中所述转移质粒与SEQ ID NO:39具有至少95％或100％的同一性。7.根据权利要求1至7中任一项所述的转移质粒，其中所述启动子是EFS启动子。8.根据权利要求7所述的转移质粒，其中所述EFS启动子与SEQ ID NO:2具有至少95％的同一性。9.根据权利要求8所述的转移质粒，其中所述EFS启动子是SEQ ID NO:2。10.根据权利要求1至9中任一项所述的转移质粒，其中所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少95％的同一性。11.根据权利要求10所述的转移质粒，其中所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少99％的同一性。12.根据权利要求11所述的转移质粒，其中所述编码多核苷酸是SEQ ID NO:3。13.根据权利要求1至12中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。14.根据权利要求13所述的转移质粒，其中所述WPRE是SEQ ID NO:4。15.根据权利要求1至14中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。16.根据权利要求1至15中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒的两侧是5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR。17.根据权利要求16所述的转移质粒，其中所述5'LTR是SEQ ID NO:34和/或所述3'LTR是SEQ ID NO:28。18.根据权利要求1至17中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。19.根据权利要求1至17中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒是SEQ ID NO:1。20.一种慢病毒颗粒，通过用权利要求1至20中任一项所述的转移质粒转染宿主细胞而产生。21.一种表达盒，包含编码T细胞免疫调节因子1(TCIRG1)或其功能性变体的同源异构体的编码多核苷酸和EFS启动子，其中所述多核苷酸可操作地连接到所述EFS启动子。22.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少95％的同一性。23.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述编码多核苷酸与SEQ ID NO:3具有至少
99％的同一性。24.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述编码多核苷酸是SEQ ID NO:3。25.根据权利要求1至4中任一项所述的表达盒，其中所述EFS启动子与SEQ ID NO:2具有至少95％的同一性。26.根据权利要求25所述的表达盒，其中所述EFS启动子是SEQ ID NO:2。27.根据权利要求21至26中任一项所述的表达盒，包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。28.根据权利要求27所述的表达盒，其中所述WPRE是SEQ ID NO:4。29.根据权利要求21至28中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。30.根据权利要求29所述的表达盒，其中所述表达盒是SEQ ID NO:1。31.一种重组慢病毒基因组，按5'到3'顺序包含：(a)慢病毒5'长末端重复序列(LTR)；(b)权利要求21至30中任一项所述的表达盒；和(c)慢病毒3
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LTR，其中所述重组慢病毒基因组不能复制。32.一种转移质粒，包含权利要求31所述的重组慢病毒基因组。33.一种慢病毒颗粒，包含权利要求31所述的重组慢病毒基因组。34.一种药物组合物，包含权利要求33所述的慢病毒颗粒。35.一种经修饰的细胞，包含权利要求21至30中任一项所述的表达盒。36.一种经修饰的细胞，包含权利要求31所述的重组慢病毒基因组。37.根据权利要求36所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞缺乏内源性功能性TCIRG1基因。38.根据权利要求36或37所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞源自患有或疑似患有婴儿恶性骨硬化病(IMO)的受试者。39.根据权利要求36至38中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞表达TCIRG1或其功能性变体，表达水平类似于在具有功能性TCIRG1基因的破骨细胞中观察到的TCIRG1表达水平。40.根据权利要求36至39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞表达TCIRG1或其功能性变体，表达水平类似于在源自未患有或未疑似患有IMO的受试者的破骨细胞中观察到的TCIRG1表达水平。41.根据权利要求36至40中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞是造血干细胞(HSC)。42.根据权利要求36至41...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：太空飞船七有限责任公司，
类型：发明
国别省市：