用于GLUT1表达的腺相关病毒载体及其用途制造技术

本文提供的是使用重组腺相关病毒(rAAV)病毒体作为表达GLUT1蛋白或其功能变体的载体，用于GLUT1缺乏综合征和相关病症的基因疗法。rAAV病毒体可以使用内皮特异性启动子，例如FLT

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于GLUT1表达的腺相关病毒载体及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2021年8月5日提交的美国申请号63/061,726的优先权，所述美国申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用并入说明书内。含有序列表的文本文件的名称是ROPA_018_01WO_ST25.txt。文本文件为约190KB，于2021年8月3日创建，并且经由EFS
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Web以电子方式提交。

技术介绍

[0005]编码葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的SLC2A1基因中的突变与称为GLUT1缺乏综合征(GLUT1 DS)的神经发育障碍相关。GLUT1 DS是一种常染色体显性遗传病症，其经常呈现为散发性疾病，具有产生单倍体不足并赋予有症状的杂合性的新生突变。
[0006]GLUT1是一种胰岛素不依赖性葡萄糖转运蛋白。患有典型GLUT1 DS也称为De Vivo病的患者具有低脑葡萄糖水平，并且显示出通过以下表征的表型：早发性癫痫发作(中位12个月)、发育迟缓、获得性小头畸形(头部生长减慢)、复杂运动障碍(痉挛状态、共济失调、肌张力障碍)；阵发性眼头运动；以及脑脊液糖分过少(hypoglycorrhachia)或脑脊液(CSF)中的低葡萄糖浓度。该疾病的临床过程揭示了早期治疗的重要性。Alter等人J.Child Neurol.30(2):160
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169(2015)。GLUT1已牵涉内皮细胞的功能，包括血管生成和血脑屏障(BBB)的维持。然而，单倍体不足小鼠模型中的研究已提供了关于GLUT1在维持BBB的物理完整性中的作用的相矛盾的证据。尽管GLUT1的内皮细胞谱系特异性敲除减少内皮能量可用性并减少增殖而不影响迁移，从而延迟发育性血管生成(Veys等人，Circ.Res.2020；127:466
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482)，但特异性地在内皮细胞中恢复GLUT1表达的效应尚未进行测试。
[0007]关于该疾病的治疗策略在Tang等人Ann.Clin.Trans.Neurol.2019；6(9):1923
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1932中进行综述。目前的护理标准是生酮饮食，其提高血液中的酮水平，所述酮取代葡萄糖，以使得它们对于脑可用。用甘油三酯三庚酸甘油酯的治疗已提议作为生酮饮食的替代方案。还已尝试了使用腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法。靶向神经元中的GLUT1缺乏，编码处于神经元特异性启动子(例如，突触蛋白)的控制下的GLUT1的AAV9载体已在年幼的产后小鼠模型中进行测试。其它研究采用组成型启动子(例如CMV启动子)或内源性GLUT1基因的启动子。还已测试了各种小分子，包括抗惊厥剂碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺及其它。
[0008]虽然GLUT1的单倍体不足阻止脑血管生成，导致相对较小的大脑微血管系统，其可能与内皮尖端细胞的葡萄糖依赖性有关，但Tang等人已观察到内皮细胞中的低GLUT1是否触发这种病理状态仍有待调查。GLUT1蛋白在另外的脑细胞中表达，所述另外的脑细胞包括少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。
[0009]存在通过基因疗法解决GLUT1 DS的多重挑战。需要的载体对CNS的覆盖程度以及达到临床上有意义的效应所需的GLUT1的治疗水平均为高度不可预测的。
[0010]存在关于用于GLUT1缺乏综合征的疗法的未满足需求。本文提供的基因疗法解决
了这一需求。

技术实现思路

[0011]本专利技术一般涉及使用编码GLUT1或其功能变体的多核苷酸的基于腺相关病毒(AAV)的递送、用于神经系统疾病或病症的基因疗法。
[0012]尽管GLUT1缺乏综合征(DS)是一种神经发育障碍，其临床表现源于适当神经元功能的缺乏，但不受理论束缚，目前的基因疗法可能靶向负责指导中枢神经系统(CNS)中的血管生成和脉管系统发育的内皮细胞。将AAV直接递送至发育中的中枢神经系统CNS脉管系统，伴随内皮尖端细胞中的后续GLUT1蛋白表达，可以在血管生成和神经发育的关键窗口期间促进整个CNS的血管生长和形成。
[0013]在一个方面，本公开内容提供了表达盒，其包含可操作地连接至启动子的编码GLUT1或其功能变体的多核苷酸序列。
[0014]在一些实施方案中，启动子是内皮启动子，任选地Tie
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1启动子、Tie
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2(TEK)启动子、FLT
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1启动子、FLK
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1(KDR)启动子、ICAM
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2启动子、VE
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钙粘蛋白(CDH5)启动子、VWF启动子、ENG启动子、PDGFB启动子、ESM1启动子、APLN启动子或封闭蛋白
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5(Ple261)启动子，条件是内皮启动子不是Glut1启动子。
[0015]在一些实施方案中，启动子是FLT
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1启动子。
[0016]在一些实施方案中，FLT
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1启动子是人FLT
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1(hFLT
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1)启动子。
[0017]在一些实施方案中，hFLT
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1启动子与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0018]在一些实施方案中，启动子是Tie
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1启动子。
[0019]在一些实施方案中，Tie
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1启动子是人Tie
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1(hTie
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1)启动子。
[0020]在一些实施方案中，hTie
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1启动子与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0021]在一些实施方案中，启动子是血管内皮
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钙粘蛋白(VE
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钙粘蛋白)启动子。
[0022]在一些实施方案中，VE
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钙粘蛋白启动子是人VE
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钙粘蛋白(hVE
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钙粘蛋白)启动子。
[0023]在一些实施方案中，hVE
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钙粘蛋白启动子与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0024]在一些实施方案中，启动子是泛在启动子。
[0025]在一些实施方案中，启动子是CMV启动子。
[0026]在一些实施方案中，启动子是CAG启动子。
[0027]在一些实施方案中，表达盒包含polyA信号，任选地人生长激素(hGH)polyA。
[0028]在一些实施方案中，表达盒包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，任选地WPRE(x本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种表达盒，其包含可操作地连接至启动子的编码GLUT1或其功能变体的多核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述启动子是内皮启动子，任选地Tie
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1启动子、Tie
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2(TEK)启动子、FLT
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1启动子、FLK
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1(KDR)启动子、ICAM
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2启动子、VE
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钙粘蛋白(CDH5)启动子、VWF启动子、ENG启动子、PDGFB启动子、ESM1启动子、APLN启动子或封闭蛋白
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5(Ple261)启动子，条件是内皮启动子不是Glut1启动子。3.根据权利要求1或权利要求2所述的表达盒，其中所述启动子是FLT
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1启动子。4.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述FLT
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1启动子是人FLT
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1(hFLT
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1)启动子。5.根据权利要求4所述的表达盒，其中所述hFLT
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1启动子与SEQ IDNO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。6.根据权利要求1或权利要求2所述的表达盒，其中所述启动子是Tie
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1启动子。7.根据权利要求6所述的表达盒，其中所述Tie
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1启动子是人Tie
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1(hTie
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1)启动子。8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述hTie
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1启动子与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。9.根据权利要求1或权利要求2所述的表达盒，其中所述启动子是血管内皮
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钙粘蛋白(VE
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钙粘蛋白)启动子。10.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述VE
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钙粘蛋白启动子是人VE
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钙粘蛋白(hVE
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钙粘蛋白)启动子。11.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述hVE
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钙粘蛋白启动子与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。12.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述启动子是泛在启动子。13.根据权利要求1或权利要求12所述的表达盒，其中所述启动子是CMV启动子。14.根据权利要求1或权利要求12所述的表达盒，其中所述启动子是CAG启动子。15.根据权利要求1至14中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含polyA信号，任选地人生长激素(hGH)polyA。16.根据权利要求1至15中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，任选地WPRE(x)。17.根据权利要求1至16中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含3'非翻译区(3
’
UTR)，其包含与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列。18.根据权利要求1至17中任一项所述的表达盒，其中编码GLUT1的所述多核苷酸序列是SLC2A1多核苷酸。19.根据权利要求18所述的表达盒，其中所述SLC2A1多核苷酸是人SLC2A1多核苷酸。20.根据权利要求17至19中任一项所述的表达盒，其中编码GLUT1的所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:5具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：太空飞船七有限责任公司，
类型：发明
国别省市：