贝类遗传图谱的快速构建方法技术

本发明专利技术涉及一种贝类遗传图谱的快速构建方法，其先后步骤包括贝类担轮幼虫的培育与保存、单个担轮幼虫的分离、ＤＮＡ的提取、及其ＤＮＡ拷贝数的增加，最后应用拟测交策略及可用于回交模型分析的遗传图谱构建软件即可获得贝类的遗传图谱。本发明专利技术的优点在于采用了贝类的担轮幼虫和拟测交策略相结合的方法进行遗传图谱构建，该方法不仅省去了成体培养所需的时间和财力，而且可以保证材料的准确可靠，同时为应用现有材料进行贝类图谱构建提供了新的思路和方法，加速了贝类遗传图谱构建进程。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属海洋生物
，具体涉及到。本专利技术的目的在于利用贝类的担轮幼虫为遗传作图材料，并采取拟测交策略来快速构建贝类的遗传图谱，为贝类的遗传图谱构建工作提供新的思路和方法。将贝类分别排放精卵后进行单对交配，并单独培育至担轮幼虫，然后取担轮幼虫置于保存液中，该保存液的成分包括20％二甲基亚枫(DMSO)，0.3M乙二胺四乙酸二纳(EDTA)，饱和NaCl。此保存液可长时间(大于1年)保存完好的幼虫形态及其内的DNA.。2.单个担轮幼虫的分离因担轮幼虫很小，需借助于一定的手段进行分离，目前对微小幼虫的分离中用的方法为液滴法(Huvet，Mar.Biotechnol.，3448)，此法只是假设每液滴中有一个幼虫，不准确。本专利技术通过显微操作来准确地分离单个幼虫。具体操作为取上述保存液中的幼虫用TE缓冲液(10Mm Tris-Cl，1mMEDTA)清洗几遍以除去保存液后，再取几十个于载玻片上，并将载波片置于显微操作仪上，用事先拉制好的玻璃针在显微镜下吸取单个幼虫，并轻轻吹入用作聚合酶链式反应的小离心管(简称PCR管)内。在进行操作时应注意观察幼虫的形状，挑选个体完整且处于担轮幼虫期的幼虫，以及玻璃针的口径应与担轮幼虫大小相适应为宜。3.单个担轮幼虫DNA的提取将以上得到的各含有1个幼虫的PCR管内各加入15ul的裂解液于55℃恒温裂解3h，升温到85℃保持15min以灭活蛋白酶K，这样所得的含有已被释放和提取DNA的裂解液即可保存于4℃待用。考虑到单个幼虫DNA含量很小，其裂解液若进行常规酚-氯仿抽提要损失部分DNA。本专利技术所采用的裂解液不含有抑制扩增的物质，可直接用于聚合酶链式反应(简称PCR反应)。裂解液配方有两种，一种成分包括10mM Tris-Cl，10mM的氯化钙(CaCl2)，0.3mg/ml蛋白酶K(PrK)，简称为配方A。另一种成分包括10mM Tris-Cl，50mM氯化钠(KCl)，0.5％吐温20(Tween-20)，0.3mg/ml PrK，简称为配方B，这两种裂解液的PH值皆为8.0。4)单个担轮幼虫DNA拷贝数增加图谱构建中需对单个幼虫进行多次聚合酶链式反应(简称PCR)以获得足够量的标记位点，而单个幼虫可提供的DNA量很少，不足以用于多位点分析。本专利技术应用已有的兼并引物随机扩增法(简称PEP法)来增加单个幼虫DNA拷贝数，以获得PCR扩增所需的足够量的模板DNA。作为例子具体可取上述所得的3ul的幼虫裂解液作为模板，加入20ul的PCR反应体系中，包括0.5uM的引物，0.2uM的dNTP，1.5U的Taq DNA聚合酶，2.0ul的10×PCR缓冲液，上述引物序列为5’-d(NNNNNNNNNNNNNNN)-3’，其PCR反应条件为95℃预变性5min后进行40～50个循环94℃ 1min，37℃ 2min，10s/℃升温到55℃，延伸4min，最后72℃保温5min。即可得到足够量的单个担轮幼虫的模板DNA。5)应用拟测交策略进行图谱构建通过以上预扩增得到足够量的单个担轮幼虫的DNA模板后，即可应用拟测交策略及可用于回交模型分析的遗传图谱构建软件如JoinMap、Mapdisto等进行图谱构建。具体步骤为首先选择各种遗传标记方法如微卫星(简称ISSR)，随机扩增的多态性DNA(简称RAPD)和扩增片段长度多态性(简称AFLP)等对单个幼虫个体进行PCR扩增，扩增产物在3.5％-4.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，进行银染显带。并应用Crosscheck软件将扩增带转化成1-0矩阵。然后选择在双亲中表现多态，且在幼虫中发生1∶1的测交分离方式位点进行连锁分析，最后将以上得到的连锁位点输入能处理回交模型的遗传图谱软件中即可得到所需的遗传图谱。为了进一步说明以上方法，作为实施例以贝类中广泛养殖的具有很高经济价值的扇贝为例进行图谱构建首先取性腺饱满栉孔扇贝一对进行单对交配，并单独培育至担轮幼虫后，取担轮幼虫保存于上述步骤1的保存液中。然后取保存液中的幼虫用TE清洗4遍后，取几十个于载玻片上，并将载玻片置于显微操作仪上，用口径大小与扇贝幼虫相对应的玻璃针在显微镜下吸取单个幼虫，并轻轻吹入小PCR管内。在以上得到的各含有1个幼虫的PCR管内各加入15ul的裂解液于55℃恒温裂解3h，升温到85℃保持15min，最后裂解液即可保存于4℃待用。裂解液选用上述步骤3中的裂解液配方中的任一种。对以上所得的单个幼虫DNA的裂解液应用上述的PEP法来增加其拷贝数，以获得足够量的单个担轮幼虫的模板DNA。取3ul以上所得的模板DNA应用上述的ISSR标记技术对其进行PCR扩增。扩增产物在3.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，进行银染显带，并应用Crosscheck软件获得1，0数据。最后应用拟测交策略进行图谱构建选择在双亲中表现多态，且在幼虫中发生1∶1拟测交分离方式位点进行连锁分析，最后将以上得到的连锁位点输入作图软件“JoinMap”进行了图谱构建。共获得了17个扇贝连锁群，包括52个ISSR标记位点，总图距为820.6cM。作为另一实施例再选择贝类中另一种经济价值更高的鲍进行遗传图谱构建取性腺饱满的皱纹盘鲍雌和日本盘鲍雄各一只进行单对交配，并单独培育至担轮幼虫，取上浮的幼虫于保存液中保存。然后按上述步骤中的2、3和4的方法进行幼虫的分离、单个幼虫DNA提取以及拷贝数增加。取3ul以上所得的模板DNA应用上述的ISSR标记技术对其进行PCR扩增。扩增产物在3.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，进行银染显带，并应用Crosscheck软件获得1，0数据。最后应用拟测交策略进行图谱构建选择在双亲中表现多态，且在幼虫中发生1∶1拟测交分离方式位点进行连锁分析，最后将以上得到的连锁位点输入作图软件“Mapdisto”进行了图谱构建。共获得12个皱纹盘鲍的连锁群，包括35个AFLP标记位点，总图距为366cM。本专利技术的优点在于采用了贝类的担轮幼虫和拟测交策略相结合的方法进行了贝类的遗传图谱构建，该方法不仅省去了成体培养所需的时间和财力，而且可以保证材料的准确可靠，同时为应用现有材料进行贝类图谱构建提供了新的思路和方法，加速了贝类遗传图谱构建进程。专利技术中所采用的保存液可长时间保持形态完好且DNA没被降解的贝类担轮幼虫；用显微操作来分离单个幼虫非常的准确快速；所用裂解液可有效的提取DNA，并且其不需抽提可直接用于PCR扩增；采用随机兼并引物扩增法可有效的增加微量DNA的拷贝数；通过以上方法得到足够量的单个幼虫的DNA，并结合拟测交策略即可得到贝类的遗传图谱。权利要求1.一种，其先后步骤包括贝类担轮幼虫的培育与保存、单个担轮幼虫的分离、单个担轮幼虫DNA的提取、及其微量DNA拷贝数增加，最后应用拟测交策略及可用于回交模型分析的遗传图谱构建软件即可获得贝类的遗传图谱。2.根据权利要求1所述的，其特征在于上述贝类担轮幼虫的培育与保存是将贝类分别排放精卵后进行单对交配，并单独培育至担轮幼虫，然后取担轮幼虫置于保存液中保存。3.根据权利要求1所述的，其特征在于上述单个担轮幼虫的分离是取上述保存液中的幼虫用TE缓冲液清洗几遍以除去保存液后，再取几十个于载玻片上，并将载玻片置于显微操作仪上，用事先拉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种贝类遗传图谱的快速构建方法，其先后步骤包括贝类担轮幼虫的培育与保存、单个担轮幼虫的分离、单个担轮幼虫ＤＮＡ的提取、及其微量ＤＮＡ拷贝数增加，最后应用拟测交策略及可用于回交模型分析的遗传图谱构建软件即可获得贝类的遗传图谱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万俊芬，包振民，潘洁，陈刚，刘广绪，王师，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]