本发明专利技术属于药物分析领域，涉及一种中药指纹图谱的测定方法，本发明专利技术公开了一种三黄方制剂成分检测方法，将供试品溶液注入UPLC‑Q‑TOF‑MS联用仪，以UPLC‑Q‑TOF‑MS法采用梯度洗脱进行测定，根据UPLC‑Q‑TOF‑MS联用仪检测结果，获得三黄方制剂的成分。本发明专利技术还公开了利用上述三黄方制剂成分检测方法，取不同批次的三黄方制剂供试品溶液按上述的方法进行检测，根据检测结果，标定共有峰，建立了三黄方制剂超高效液相色谱‑高分辨‑飞行时间质谱联用指纹图谱。该方法和指纹图谱可作为三黄方制剂质量控制与分析的有效方法之一。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物分析领域，涉及中药指橘绿木霉菌谱的测定方法，尤其涉及一种三黄方制剂成分检测方法及超高效液相色谱-高分辨-飞行时间质谱联用指纹图谱构建方法。
技术介绍
中药指纹图谱是采用现代分析技术建立的能反映中药材或中成药的某类或几类成分的色谱或光谱信息的图谱，能较全面地反映中药的整体化学特征，体现其内在的整体质量，可弥补仅用少数成分来控制中药质量的弊端，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段。然而，中药化学成分的多样性和复杂性以及药效物质基础的不确定性，增加了中药指纹图谱建立的难度以及指纹图谱的有效和重复性。目前，中药指纹图谱研究较多的是中药化学指纹图谱，是采用色谱、波谱和其他分析方法建立的用于表征中药化学成分特征的指纹图谱。高效液相色谱(HPLC)具有分离效能高、分析速度快、重现性好的特点，以及可配合不同检测器来分析各种类型样品的优势，已成为公认的建立中药指纹图谱的主导方法。近年来兴起的超高效液相色谱技术(UPLC)具有超高压、超高灵敏度、超高分离度等特点，它借助HPLC的理论与原理，采用1.7μm粒径的色谱柱填料，能使一次指纹图谱的分析时间由原来的至少1小时缩短为为10min左右，并且色谱峰容量和稳定性也显著提高，UPLC在中药及天然产物等复杂体系的分离分析上具有明显优势，为中药指纹图谱研究提供了新的分离平台。紫外(UV)检测器是目前与液相色谱联用进行指纹图谱研究应用最广泛的检测方法。然而化学成分的紫外吸光度有加和性，从而使测定结果产生偏差，不能真实反映中药化学成分的含量。而且紫外检测法只适合具有紫外吸收的中药化学成分，对于无紫外吸收或吸收较弱的成分，难以进行有效测定。特别本复方制剂中君药黄芪中标志性重要化学成分三萜皂苷类(如黄芪甲苷IV等)以及佐药泽泻中标志性重要化学成分原帖烷三萜类成分(如泽泻醇A等)在紫外区吸收很弱并且干扰较多，不适合用紫外检测器测定。质谱(MS)检测器可用于中药中各种化合物的检测，均可产生较好的响应，是一种高灵敏度的通用检测器，更重要的是能提供化合物的分子量和分子结构信息(串联质谱)。采用质谱检测器，通过确定离子的质量扫描范围，可以使其包含所有目标化合物的信息。应用总离子流检测模式，可以综合化合物的全部信息；进而，通过考查共有色谱峰的质谱信息，可以确定色谱峰的组成情况，保证色谱峰为单一化合物组成，具有较好的科学性。由于中药化学成分的复杂性，保证中药指纹图谱中的色谱峰为单一化合物峰是很难的或者说几乎不可能，而采用质谱检测器，可以从总离子流色谱图(TIC)中提取特定m/z的离子，建立提取离子色谱图(EIC)，从而保证了色谱峰为单一化合物组成。另外，通过对共有峰进行质谱定性，建立共有峰的提取离子色谱图，进而通过色谱峰与化合物m/z的一一对应关系，实现对各共有峰的准确定位和测量，从而可弥补其它方法、实验室之间的重现性差的缺点。飞行时间串联质谱仪(Q-TOF-MS)是高分辨串联质谱，其显著特点是高灵敏度、高选择性，能得到高质量质谱图和化合物精确分子量(质量精度<3×106)，能大大提高化合物结构鉴定的准确性。UPLC-Q-TOF-MS结合了非常优良的色谱分离能力和非常灵敏、非常智能的检测能力，在中药化学指纹图谱中极具发展前景和空间，优势突出，特点明显，必将成为中药指纹图谱的发展趋势和方向。三黄方为复旦大学附属华山医院协定处方，由黄芪、黄连、泽泻、蒲黄、茵陈配伍而成，多年来临床应用于治疗代谢综合症和非酒精性脂肪肝，为中医科早期协定处方益气散聚方(专利号：200810034507.3)的精简方(专利申请号：201511018056.0)，具有益气散聚功效，能够改善患者体征与体内胰岛素抵抗状态、能促进气血精微正常运化，纠正机体代谢异常，即具有益气散结、清热化痰、祛湿降浊、调脂化瘀的作用。由于黄芪中重要有效成分如黄芪皂苷IV等三萜皂苷类以及泽泻中重要有效成分如泽泻醇及其酯类等原萜烷三萜类的紫外吸收较差，一般的紫外检测器检测灵敏度较差；蒸发光散射检测器灵敏度也比较差，限制了含这两种中药的复方制剂的指纹图谱研究。目前为止我们报道了采用2成分、4个成分含量测定方法控制三黄方制剂的含量，但是仍没有其多成分含量测定以及利用UPLC-Q-TOF-MS进行质量控制的报道。本专利技术基于《中国药典》2015版对5种组成中药的质量鉴定所需测定的种11种化学成分(黄芪为黄芪甲苷IV、毛蕊异黄酮葡萄糖苷；黄连为表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱；泽泻为23-乙酰泽泻醇B；生蒲黄为异鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷；茵陈为绿原酸与滨蒿内酯)以及国家食品药品监督管理局标准品目录，并参考三黄方制剂血清化学研究(18种成分能够入血)，选择出的23种指纹图谱测定指标除了涵盖以上化学成分并分别针对药典中对5种中药特别生蒲黄、泽泻所需检测目标成分较少的缺点新增了12种化学成分，并经10批三黄方溶液指纹图谱的测定，初步确定共有化学成分，作为三黄方制剂质量控制的参考方法。本技术基于高端液相测定技术，所需设备尚未在国内大量普及，但对于一般综合性大学与大型中药生产药企都为必备配备。三黄方制剂目前已基本完成临床前研究，将初步作为复旦大学附属华山医院院内开发制剂，其制剂尚未大规模生产，目前的指纹图谱主要作为参考图谱，但本测定方法可以作为三黄方制剂的质量控制方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种利用UPLC-Q-TOF-MS简单快速进行三黄方制剂质量控制的方法，以及由此方法所构建的三黄方制剂指纹图谱。本专利技术的第一个目的是提供一种三黄方制剂成分检测方法，包括以下步骤：步骤1：供试品溶液的制备取黄芪、黄连、泽泻、生蒲黄和茵陈，用水和乙醇提取，定容，得到供试品溶液；步骤2：供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入UPLC-Q-TOF-MS联用仪，以UPLC-Q-TOF-MS法采用梯度洗脱进行测定，根据UPLC-Q-TOF-MS联用仪检测结果，获得三黄方制剂的成分。优选地，上述的步骤1具体包括以下步骤：步骤a：将黄芪、黄连、泽泻、生蒲黄和茵陈用纯化水浸泡后，再加入纯化水同煮，然后滤取药液并浓缩处理得到浓缩药液；步骤b：往步骤a得到的浓缩药液中加入乙醇搅拌均匀后，常温沉淀24小时，然后取上清液回收乙醇并进行浓缩处理，再次取上清液回收乙醇并进行浓缩处理，得到浓缩液；步骤c：往步骤b得到的浓缩液中加入水搅拌均匀后，沉淀24小时，然后将上清液进行浓缩处理，定容得到供试品溶液。优选地，上述的步骤1中按重量比计算，各组分含量分别为：黄芪1-4份；黄连1份；泽泻1-3份；生蒲黄1-3份；茵陈1-3份。优选地，上述步骤2中UPLC色谱条件为：流动相为0.1％的甲酸水-0.1％的甲酸乙腈；流速0.3-0.5mL/min；柱温35-50℃；进样量1-5μL。优选地，上述步骤2中UPLC色谱测定方式为正负离子全扫描，电喷雾(ESI)离子源检测模式；扫描质量范围为100-1000Da。优选地，上述步骤2中UPLC色谱的色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱。优选地，上述的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱的色谱条件为：流速0.4mL/min，柱温45-50℃，进样量1-5μL。本专利技术的第本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三黄方制剂成分检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：供试品溶液的制备取黄芪、黄连、泽泻、生蒲黄和茵陈，用水和乙醇进行浓缩处理，得到供试品溶液；步骤2：供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入UPLC‑Q‑TOF‑MS联用仪，以UPLC‑Q‑TOF‑MS法采用梯度洗脱进行测定，根据UPLC‑Q‑TOF‑MS联用仪检测结果，获得三黄方制剂的成分。
【技术特征摘要】
1.一种三黄方制剂成分检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：供试品溶液的制备取黄芪、黄连、泽泻、生蒲黄和茵陈，用水和乙醇进行浓缩处理，得到供试品溶液；步骤2：供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入UPLC-Q-TOF-MS联用仪，以UPLC-Q-TOF-MS法采用梯度洗脱进行测定，根据UPLC-Q-TOF-MS联用仪检测结果，获得三黄方制剂的成分。2.根据权利要求1所述的三黄方制剂成分检测方法，其特征在于，所述的步骤1具体包括以下步骤：步骤a：将黄芪、黄连、泽泻、生蒲黄和茵陈用纯化水浸泡后，再加入纯化水同煮，然后滤取药液并浓缩处理得到浓缩药液；步骤b：往步骤a得到的浓缩药液中加入乙醇搅拌均匀后，常温沉淀24小时，然后取上清液回收乙醇并进行浓缩处理，再次取上清液回收乙醇并进行浓缩处理，得到浓缩液；步骤c：往步骤b得到的浓缩液中加入水搅拌均匀后，沉淀24小时，然后将上清液进行浓缩处理，定容得到供试品溶液。3.根据权利要求1所述的三黄方制剂成分检测方法，其特征在于，所述的步骤1中黄芪、黄连、泽泻、生蒲黄和茵陈，按重量份计算，各组分含量分别为：黄芪1-4份；黄连1份；泽泻1-3份；生蒲黄1-3份；茵陈1-3份。4.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆丰，钟明康，焦正，王文健，刘毅，王斌，施孝金，李中东，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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