一种富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开一种用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的方法，为：先使用差速离心法进行初步分离，然后将粗提后的样品使用碘海醇密度梯度离心法进一步纯化。通过本发明专利技术方法提取的污水微生物纯度高，可达到单细胞分选的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的试剂盒及方法
本专利技术涉及水处理
，具体涉及一种富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的试剂盒及方法。
技术介绍
水体富营养化是全球普遍存在的严重环境问题，在引起水体富营养化的营养元素中，氮磷等营养盐被认为是引起水体富营养化的关键因素。为了解决氮磷污染带来的危害，在污水进入水体前进行有效的处理，降低排放污水的氮磷浓度是十分必要的。目前污水的除氮磷技术主要是化学法，但化学除氮磷时污泥产生量较大，还会引起二次污染，因此生物除氮磷技术是目前研究的热点。目前国内外对降解氮磷的微生物有许多相关报道，但大部分是集中在对土壤微生物的研究，而对从污水中分离出的氮磷菌的研究报道比较少。我们期待从环境污水中筛选出氮磷等营养盐的降解菌，并对其进行菌种识别鉴定和除氮解磷能力测定，目前主流的研究方法都是基于培养基再培养的，而对于当前尚未实现培养的除氮解磷微生物缺乏研究的技术手段。CN200480017549.6及其同族10件专利为纯化细菌微细胞的方法，主要使用密度梯度离心(碘克沙醇)，选择性的包括初步差速离心和过滤步骤，主要用于纯化用于药学研究的微细胞，经纯化的微细胞制备物，每107、108、109、1010以及1011个微细胞含有少于大约1个污染的亲代细菌细胞。WOUS01023624为密度梯度离心所使用的装置专利，没有密度梯度离心与差速离心两种方法的连用。本专利技术旨在为不依赖于培养的氮磷降解菌单细胞精度的表型识别和单细胞功能分选提供污水微生物的高纯度富集方法，为进一步研究氮磷降解菌和有效利用污水处理厂的污水微生物提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的试剂盒及方法。本专利技术为实现污水微生物单细胞精度的表型测量及单细胞分选提供高纯度的污水微生物富集物，可耦合下游光学图像、荧光图像和拉曼光谱等多种表型观测模式，能以较低的成本得到污水微生物单细胞精度的快速表型检测及分选的初始样本。本专利技术所提供的用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的方法，为：先使用差速离心法进行初步分离，然后将粗提后的样品使用碘海醇密度梯度离心法进一步纯化。具体地，本专利技术所提供的用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的方法，包括如下步骤：1)使用差速离心法进行初步分离：取污水样品于离心管a，4℃、10000rpm离心5min；弃上清，向沉淀加入分离缓冲液，震荡混匀2-3min，4℃、1500rpm离心5min；将离心管a取出，取上清A到离心管b中，4℃、1000rpm离心3min；取上清B到无菌离心管c中，4℃、10000rpm离心5min；弃上清，得到沉淀；2)碘海醇密度梯度离心法纯化：向所得沉淀中加入分离缓冲液，混匀后加到碘海醇溶液上层，4℃，14000g离心30min，离心结束后将管子取出，可见溶液有明显分层，中间层为细胞层，吸取中间层转移到新的无菌1.5mL离心管；超纯水洗样，收集下层沉淀，即为富集的微生物。上述方法步骤1)中，所述分离缓冲液通过如下方法制备得到：准确称取0.43gNaCl溶于500mL无菌水中，待充分溶解后再加入250μLTween-20，然后置于121℃高压灭菌锅内灭菌20min，即得。污水样品与分离缓冲液的体积比可为：1:2-4:1，具体可为25mL：40mL；步骤2)中向差速离心所得沉淀中加入的分离缓冲液与步骤1)中所取污水样品的体积比可为：1:4-1:32，具体可为5mL：25mL；步骤2)中，所述碘海醇溶液为质量浓度80％的碘海醇溶液，通过如下方法制备得到：称取4g碘海醇加入到5mL无菌水中，震荡混匀，即得。步骤2)中，超纯水洗样可进行多次，具体可进行三次，每次10000rpm离心5min；若所得下层沉淀中有残留的污泥，可加入适量超纯水，抽吸混匀后，静置5-10min，污泥即沉降到试管底部，由于微生物在溶液中，吸取上层溶液可获得较纯的微生物样品。本专利技术还提供一种用于富集污水微生物的试剂盒，所述试剂盒用于污水中微生物的提取，可最大限度地保证种类的多样性，如变形菌，拟杆菌，螺旋菌，伯克氏菌等微生物。本专利技术所提供的富集污水微生物的试剂盒，由以下物质组成：NaCl，碘海醇(Nycodenz)，Tween-20，无菌水和ddH2O，应用时，现配现用，具体操作如下：准确称取0.43gNaCl溶于500mL无菌水中，待充分溶解后再加入250μLTween-20，得到分离缓冲液；称取4g碘海醇加入到5mL无菌水中，震荡混匀，得到质量浓度80％的碘海醇溶液。上述富集污水微生物的方法及采用的用于富集污水微生物的试剂盒在污水微生物单细胞精度表型测量和分选中的应用也属于本专利技术的保护范围。对接单细胞精度测量和分选的污水微生物样本要求纯度极高，不能有杂质污染。通过本专利技术方法提取的污水微生物纯度高，可达到单细胞分选的要求。附图说明图1为本专利技术的综合法提取污水中微生物的流程图。图2为本专利技术的提取过程中微生物的成像图。标尺：20μm。图3为经本专利技术的提取方法提取所得污水微生物中不同形态微生物的拉曼图谱。A为100x镜下污水微生物图像；B为不同微生物细胞相对应的拉曼图谱。图4为目的细胞MDA扩增产物和16SrRNA基因验证产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。图5为采用本专利技术实施例的综合法提取的污水微生物和采用对比例1和2的方法提取得到的无水微生物成像图对比。A.污水处理前50x成像图；B.差速离心法提取污水微生物50x成像图；C.密度梯度离心法提取污水微生物50x成像图；D.综合法提取污水微生物50x成像图。标尺：20μm。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供一种用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的预处理试剂盒及方法。本专利技术为实现污水微生物单细胞精度的表型测量及单细胞分选提供高纯度的污水微生物富集物，可耦合下游光学图像、荧光图像和拉曼光谱等多种表型观测模式，能以较低的成本得到污水微生物单细胞精度的快速表型检测及分选的初始样本。本专利技术所提供的用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的方法，为：先使用差速离心法进行初步分离，然后将粗提后的样品使用碘海醇密度梯度离心法进一步纯化。具体地，本专利技术所提供的用于富集污水微生物以用于单细胞精度表型测量和分选的方法，包括如下步骤：1)使用差速离心法进行初步分离：取污水样品于离心管a，4℃、10000rpm离心5min；弃上清，向沉淀加入分离缓冲液，震荡混匀2-3min，4℃、1500rpm离心5min；将离心管a取出，取上清A到离心管b中，4℃、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富集污水微生物的方法，为：先使用差速离心法进行初步分离，然后将粗提后的样品使用碘海醇密度梯度离心法进一步纯化。/n

【技术特征摘要】
1.一种富集污水微生物的方法，为：先使用差速离心法进行初步分离，然后将粗提后的样品使用碘海醇密度梯度离心法进一步纯化。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)使用差速离心法进行初步分离：取污水样品于离心管a，4℃、10000rpm离心5min；弃上清，向沉淀加入分离缓冲液，震荡混匀2-3min，4℃、1500rpm离心5min；将离心管a取出，取上清A到离心管b中，4℃、1000rpm离心3min；取上清B到无菌离心管c中，4℃、10000rpm离心5min；弃上清，得到沉淀；
2)碘海醇密度梯度离心法纯化：向所得沉淀中加入分离缓冲液，混匀后加到碘海醇溶液上层，4℃，14000g离心30min，离心结束后将管子取出，可见溶液有明显分层，中间层为细胞层，吸取中间层转移到新的无菌1.5mL离心管；超纯水洗样，收集下层沉淀，即为富集的微生物。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述分离缓冲液通过如下方法制备得到：准确称取0.43gNaCl溶于500mL无菌水中，待充分溶解后再加入250μLTween-20，然后置于121℃高压灭菌锅内灭菌20min，即得；
污水样品与分离缓冲液的体积比为：1:2-4:1。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤2)中向...

【专利技术属性】
技术研发人员：荆晓艳，潘慧慧，孟宇，籍月彤，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37