产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用技术

本发明专利技术公开一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用，包括步骤：步骤一、采样及样品处理；步骤二、富集培养；步骤三、初筛；步骤四、复筛。本发明专利技术中发酵所产细菌素具有广泛的抗菌谱，对常见的致病菌如单核细胞增生李斯特菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，并能抑制包括副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌和大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌。本发明专利技术采用粗料培养基作为发酵原料，具有工艺简单、酶活性高、单位酶活生产成本低廉等优点，为阿魏酸酯酶的低成本化大规模生产提供依据。

【技术实现步骤摘要】
产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用
本专利技术涉及一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用。
技术介绍
细菌素是细菌核糖体合成的抗菌肽，通常对多种致病菌具有杀菌作用，具有抗菌谱广、无毒、可被动物肠道蛋白酶降解等特性，在饲料工业中可以替代常规抗生素使用。饲料中大量添加亚治疗量的抗生素和促生长剂，造成了动物的耐药性。由于这种多抗性、顽固病菌的出现，使传统抗生素面临重大挑战。细菌素是被认为替代抗生素的最有前途的产品。它是一种具有杀菌的无毒小分子多肽。它可选择性地分解细菌细胞壁细胞膜杀死致病菌，且本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于饲料加工、医学、食品工业、畜牧业、啤酒工业、水产养殖等领域；可替代抗生素在饲料中应用，具有庞大的市场。细菌素主要由乳酸菌及芽孢杆菌属细菌发酵获得。芽孢杆菌产细菌素与乳酸菌产生的细菌素不同，乳酸菌细菌素抗菌谱窄和pH稳定性差，芽孢杆菌产生的细菌素在抑制活性和pH方面表现出更好的优越性。阿魏酯酶(FAEs，E.C.3.1.1.73)是一类羧酸酯酶，催化植物细胞壁上羟基肉桂酸和糖之间的酯键水解，从植物细胞壁释放阿魏酸，它可以显著提高麦麸、玉米芯、玉米麸皮和草木质纤维素等材料的生物降解率，在动物饲料开发中显示出巨大的应用前景。然而，大多数报道的FAEs均为碱性或中性，在动物的酸性胃肠道环境中不能有效使用，限制了其在动物饲料中的应用。因此，寻找既安全又能直接用于动物胃肠道的新型FAEs是一项有价值的工作。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法及应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法，包括步骤：步骤一、采样及样品处理从不同大蒜种植地土壤中取土样50份，称取每份土样10g，置于装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中，使用发酵振荡器在120r/min旋转振荡混匀1h，然后将三角瓶置于80℃震荡水浴锅中，震荡孵育处理30-40min，获得土样悬浊液；步骤二、富集培养从步骤一的土样悬浊液三角瓶中吸取1-2mL悬浊液到装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养2-3d，将以上培养液于5000-6000r/min离心10-15min，无菌操作下收集菌体，然后加入无菌水充分吹打悬浮，再次于以上相同条件下离心，洗涤菌体，离心后收集菌体并按照初始培养液每100ml加入50ml无菌水重复悬浮，吸取1-2ml悬浮液接种于装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养4-6d，得到富集培养菌液；所述富集培养基包括蛋白胨1-2g、玉米芯粉10-20g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaNO31-3g、(NH4)2SO42-4g、KH2PO40.5-1g、KCl0.1-0.5g，去离子水加至1000ml，调节pH7.0-7.5，培养基121℃、15min灭菌；步骤三、初筛将经两次富集培养后的菌液充分系列稀释104～108倍，然后吸取各稀释液100-200μL于阿魏酸酯酶初筛培养基上，充分涂布均匀并晾干表面，于35-40℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后在28-32℃倒置培养24-48h，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现；将透明圈菌落挑出在牛肉膏蛋白胨培养基上充分划线三次，将充分划线获得的单菌落点到平行的两个细菌素初筛培养基二上，其中一个培养皿命名为培养皿一，另一个命名为培养皿二，于35-38℃恒温培养箱中倒置培养24-36h，然后在30-35℃倒置培养24-48h；将培养皿置于超净工作台上，开启可产臭氧的紫外灯，照射1-2h，将培养皿一中加入500-1000μL浓度为5mg/ml的复合蛋白酶液，并使酶液完全覆盖平板表面，将该平板封口膜封口并置于37℃恒温培养箱中孵育6-12h，培养皿二不用蛋白酶处理；然后将培养至对数期的金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至1×106CFU/mL，吸取0.5-1mL菌悬液平行加到培养皿一和培养皿二上，旋转培养皿，使菌悬液充分在平板上展开，然后将残余菌液倒掉，并晾干培养基表面，于35-38℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，观察抑菌圈情况；所述阿魏酸酯酶初筛培养基包括牛肉膏5-10g、酵母提取物5-10g、蔗糖10-20g、NaNO31-3g、(NH4)2SO42-4g、KH2PO40.5-1g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.2-0.4g、FeSO4·7H2O0.01-0.02g、琼脂粉15g，补充去离子水至1000mL，调节pH7.0-7.5；培养基121℃、15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径90mm的培养皿中；阿魏酸乙酯溶液包括将0.2g阿魏酸乙酯加到1.5mL无菌离心管中，再加入500μLN、N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500μL无菌水，充分摇匀；细菌素初筛培养基包括蛋白胨10-15g、酵母提取物5-10g、葡萄糖10-20g、玉米浆干粉5-10g、尿素2-4g、(NH4)2SO41-2g、KH2PO40.5-1g、KCl0.2-0.5g、MgSO4·7H2O0.2-0.4g、琼脂粉15g，补充去离子水至1000mL，调节pH7.0-7.5、培养基121℃、15min灭菌；步骤四、复筛初筛得到菌株于活化固体培养基上划线培养充分活化，32-37℃恒温培养箱培养20-24h，将活化好的菌株接种到种子培养基三角瓶中，种子培养基装液量20-40mL/250ml三角瓶，培养温度为32-37℃，摇床转速160-180r/min，培养时间18-24h，按照6-12％的接种量接种到复筛发酵培养基中，250mL三角瓶的装液量为30-60mL；在摇床上以160-200r/min的震荡频率32-37℃温度下发酵培养36-48h，将发酵液在4℃下、8000-10000r/min转速离心10-15min，保留上清，分别检测阿魏酸酯酶活性和细菌素抑菌活性；种子培养基：蛋白胨5-10g、牛肉膏4-10g、酵母粉5-8g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaCl1-5g、K2HPO40.1-0.2g，加去离子水至1000mL，pH7.0-7.5，121℃，灭菌15min；复筛发酵培养基：玉米淀粉10-20g、蛋白胨5-10g、酵母粉5-8g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaCl2-5g、尿素1-4g、KH2PO40.1-0.2g、Tween800.15-0.3g、MgSO4·7H2O0.04g，去离子水加至1000mL，pH7.0-7.5，121℃，灭菌15min。另外，本专利技术还提供了一种所述凝结芽孢杆菌的应用，包括步骤：步骤一、液体发酵剂的制备a)菌种活化：取甘油冷冻保存的凝结芽孢杆菌菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上初次划线后，30-37℃培养24本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括步骤：/n步骤一、采样及样品处理/n从不同大蒜种植地土壤中取土样50份，称取每份土样10g，置于装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中，使用发酵振荡器在120r/min旋转振荡混匀1h，然后将三角瓶置于80℃震荡水浴锅中，震荡孵育处理30-40min，获得土样悬浊液；/n步骤二、富集培养/n从步骤一的土样悬浊液三角瓶中吸取1-2mL悬浊液到装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养2-3d，将以上培养液于5000-6000r/min离心10-15min，无菌操作下收集菌体，然后加入无菌水充分吹打悬浮，再次于以上相同条件下离心，洗涤菌体，离心后收集菌体并按照初始培养液每100ml加入50ml无菌水重复悬浮，吸取1-2ml悬浮液接种于装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养4-6d，得到富集培养菌液；/n所述富集培养基包括蛋白胨1-2g、玉米芯粉10-20g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaNO

【技术特征摘要】
1.一种产细菌素与阿魏酸酯酶的凝结芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括步骤：
步骤一、采样及样品处理
从不同大蒜种植地土壤中取土样50份，称取每份土样10g，置于装有玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中，使用发酵振荡器在120r/min旋转振荡混匀1h，然后将三角瓶置于80℃震荡水浴锅中，震荡孵育处理30-40min，获得土样悬浊液；
步骤二、富集培养
从步骤一的土样悬浊液三角瓶中吸取1-2mL悬浊液到装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养2-3d，将以上培养液于5000-6000r/min离心10-15min，无菌操作下收集菌体，然后加入无菌水充分吹打悬浮，再次于以上相同条件下离心，洗涤菌体，离心后收集菌体并按照初始培养液每100ml加入50ml无菌水重复悬浮，吸取1-2ml悬浮液接种于装有20-50ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-40℃下于摇床上160-200r/min震荡培养4-6d，得到富集培养菌液；
所述富集培养基包括蛋白胨1-2g、玉米芯粉10-20g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaNO31-3g、(NH4)2SO42-4g、KH2PO40.5-1g、KCl0.1-0.5g，去离子水加至1000ml，调节pH7.0-7.5，培养基121℃、15min灭菌；
步骤三、初筛
将经两次富集培养后的菌液充分系列稀释104～108倍，然后吸取各稀释液100-200μL于阿魏酸酯酶初筛培养基上，充分涂布均匀并晾干表面，于35-40℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后在28-32℃倒置培养24-48h，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现；将透明圈菌落挑出在牛肉膏蛋白胨培养基上充分划线三次，将充分划线获得的单菌落点到平行的两个细菌素初筛培养基二上，其中一个培养皿命名为培养皿一，另一个命名为培养皿二，于35-38℃恒温培养箱中倒置培养24-36h，然后在30-35℃倒置培养24-48h；将培养皿置于超净工作台上，开启可产臭氧的紫外灯，照射1-2h，将培养皿一中加入500-1000μL浓度为5mg/ml的复合蛋白酶液，并使酶液完全覆盖平板表面，将该平板封口膜封口并置于37℃恒温培养箱中孵育6-12h，培养皿二不用蛋白酶处理；然后将培养至对数期的金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至1×106CFU/mL，吸取0.5-1mL菌悬液平行加到培养皿一和培养皿二上，旋转培养皿，使菌悬液充分在平板上展开，然后将残余菌液倒掉，并晾干培养基表面，于35-38℃恒温培养箱中倒置培养18-24h，观察抑菌圈情况；
所述阿魏酸酯酶初筛培养基包括牛肉膏5-10g、酵母提取物5-10g、蔗糖10-20g、NaNO31-3g、(NH4)2SO42-4g、KH2PO40.5-1g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.2-0.4g、FeSO4·7H2O0.01-0.02g、琼脂粉15g，补充去离子水至1000mL，调节pH7.0-7.5；培养基121℃、15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径90mm的培养皿中；
阿魏酸乙酯溶液包括将0.2g阿魏酸乙酯加到1.5mL无菌离心管中，再加入500μLN、N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500μL无菌水，充分摇匀；
细菌素初筛培养基包括蛋白胨10-15g、酵母提取物5-10g、葡萄糖10-20g、玉米浆干粉5-10g、尿素2-4g、(NH4)2SO41-2g、KH2PO40.5-1g、KCl0.2-0.5g、MgSO4·7H2O0.2-0.4g、琼脂粉15g，补充去离子水至1000mL，调节pH7.0-7.5、培养基121℃、15min灭菌；
步骤四、复筛
初筛得到菌株于活化固体培养基上划线培养充分活化，32-37℃恒温培养箱培养20-24h，将活化好的菌株接种到种子培养基三角瓶中，种子培养基装液量20-40mL/250ml三角瓶，培养温度为32-37℃，摇床转速160-180r/min，培养时间18-24h，按照6-12％的接种量接种到复筛发酵培养基中，250mL三角瓶的装液量为30-60mL；在摇床上以160-200r/min的震荡频率32-37℃温度下发酵培养36-48h，将发酵液在4℃下、8000-10000r/min转速离心10-15min，保留上清，分别检测阿魏酸酯酶活性和细菌素抑菌活性；
种子培养基：蛋白胨5-10g、牛肉膏4-10g、酵母粉5-8g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaCl1-5g、K2HPO40.1-0.2g，加去离子水至1000mL，pH7.0-7.5，121℃，灭菌15min；
复筛发酵培养基：玉米淀粉10-20g、蛋白胨5-10g、酵母粉5-8g、阿魏酸乙酯0.5-2g、NaCl2-5g、尿素1-4g、KH2PO40.1-0.2g、Tween800.15-0.3g、MgSO4·7H2O0.04g，去离子水加至1000mL，pH7.0-7.5，121℃，灭菌15min。


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【专利技术属性】
技术研发人员：陈腾，丁飞鸿，张娜，耿云龙，高兆建，赵宜峰，焦魏，张传丽，孙会刚，张建萍，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32