一种土壤功能性微生物筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种土壤功能性微生物筛选方法。所述方法在循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置中进行，包括如下步骤：在流化床体内填充供试土壤；先开启所述气泵，后通过蠕动泵加入液体培养基；在气泵通入的气体的作用下，供试土壤中的固体颗粒被带出，气体与固体颗粒分离后，在蠕动泵的作用下以流态化状态循环流动；定期取样，并分别涂布于固体培养基上进行培养，经分离、提纯得到单菌落，即实现对土壤中功能性微生物的筛选。本发明专利技术筛选过程中土壤保持原有结构，功能受影响较小；环流液体含有氧气使得土壤中有氧气分布；采取土壤样品时可以只采取环流液，使得采样容易，同时土壤本身也可供采样；环流液体可随时替换，满足不同实验需求。

【技术实现步骤摘要】
一种土壤功能性微生物筛选方法
本专利技术涉及一种土壤功能性微生物筛选方法，属于微生物筛选

技术介绍
筛选对污染物具有高效降解能力并能够抵抗土著微生物竞争的微生物制剂是生物强化修复技术的基础。富集培养技术(enrichmentculture)是通过选择某些因子(如碳源、氮源、通气条件、电子受体、温度、pH或光照等)形成特殊的环境条件，并以含有各种微生物的样品(如土壤或污泥)作为筛选源，使最适应该生长条件的微生物生长速率超过其他微生物。在同样条件下反复培养，可分离出富集的菌株，例如通过液相富集培养方法便可得到多株高效降解污染物的微生物。传统的方法为液相富集培养，因其条件与土壤环境差别较大，培养过程破坏了原土壤环境中微生物群落相互作用，所得到的微生物菌群多样性大大降低，导致其应用于生物强化修复时不能发挥预期的作用。因此，需要提供一种高效快速的土壤功能微生物的筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种土壤功能性微生物筛选方法，即土壤环流法(soilperfusion)，该方法不打乱土壤体系，不破坏土壤的结构，在尽可能接近于自然状态下筛选分离土壤中微生物，有利于筛选能够适应土壤生态环境的微生物制剂。本专利技术所提供的土壤功能性微生物筛选方法在循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置中进行，所述循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置的结构如下：包括流化床体、气泵和蠕动泵；所述流化床体的上部和下部分别配合有出液器和进液器，所述出液器和所述进液器与所述流化床体之间设有多孔筛板；所述出液器上设有出液口和排气口/取样口；所述进液器上设有两个接口，分别与所述气泵和所述蠕动泵连接，所述蠕动泵的入口与所述出液口连接。优选地，所述流化床体为圆柱体，具有内部空间利用率高、节约放置空间的优点；优选地，所述流化床体的材质可为透明的有机玻璃，以方便观察流化态情况，保证光照；如需避光培养，可用覆盖物遮住进行。优选地，所述出液器和所述进液器均为圆柱体。优选地，所述多孔筛板上设有若干圆孔，所述圆孔的孔径可为3～5mm，优选为4mm。优选地，所述出液器与所述多孔筛板之间、所述多孔筛板与所述流化床体之间以及所述多孔筛板与所述进液器之间均设有密封垫片，所述密封垫片起到密封作用，以加强所述多孔筛板与所述流化床体之间的契合。优选地，设于所述流化床体与所述进液器之间的所述多孔筛板的上部设有纱布，用来阻挡细沙流入底部，堵塞小管口影响流通与蠕动。采用所述循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置进行土壤微生物筛选时，按照如下步骤进行：S1、在所述流化床体内填充供试土壤；所述供试土壤为受污染的土壤；S2、先开启所述气泵，后通过蠕动泵加入液体培养基；在所述气泵通入的气体的作用下，所述供试土壤中的固体颗粒被带出，所述气体与所述固体颗粒分离后，在所述蠕动泵的作用下以流态化状态循环流动；S3、定期取样，并分别涂布于固体培养基上进行培养，经分离、提纯得到单菌落，即实现对土壤中功能性微生物的筛选；上述的筛选方法中，步骤S1之前，对所述循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置进行灭菌处理，如于115℃下灭菌20min。上述的筛选方法中，步骤S1中，所述液体培养基为常规的无机盐培养基，配方如下：NH4NO31.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，NaCl1.0g，MgSO4·7H2O0.2g，去离子水1000mL，pH＝7.2～7.5，实际应用时可根据土壤理化性质进行微调。上述的筛选方法中，步骤S2中，所述气泵的排气量为2～3.2L/min；所述蠕动泵的转速为170～200r/min。上述的筛选方法中，步骤S3中，所述固体培养基为LB固体培养基、PDA固体培养基或无机盐固体培养基。上述的筛选方法中，步骤S3中，取样后进行稀释，然后涂布于所述固体培养基上进行培养。本专利技术提供的土壤环流驯化法可应用于百菌清、二氯喹啉酸降解、秸秆腐化、重金属钝化、有机物降解等功能性微生物的筛选，相比传统筛菌方法优势明显，微生态结构丰富，真菌筛选特异性强，且取样简单、方便。本专利技术方法打破了传统液相富集法中三角瓶易碎、难清洗、多次培养工作量大等问题。本专利技术筛选过程能保证所有土壤固体颗粒物处于均一的光照、温度、湿度、流化式使土壤被充分分解，使气-固-液三相充分接触，更适合细菌和真菌的生长，在一定时间内筛出更多的微生物尤其是真菌，加大了微生物数量和微生物种类的筛选率，此方法选得到的菌群则具有多样性。本专利技术筛选过程中土壤保持原有结构，功能受影响较小；环流液体含有氧气使得土壤中有氧气分布；采取土壤样品时可以只采取环流液，使得采样容易，同时土壤本身也可供采样；装置内通入气体可控，可使用其他气体营造厌氧或其他特殊环境；环流液体可随时替换，满足不同实验需求。本专利技术筛选方法具有广阔的实际应用前景。附图说明图1为本专利技术筛选方法采用的循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置的结构示意图，图中各标记：1-排气口/取样口，2-多孔筛板，3-密封垫片，4-流化床体，5-气泵，6-蠕动泵，7-出液器，8-进液器。图2为本专利技术实施例1筛选的菌株对百菌清的降解效果。图3为本专利技术实施例2筛选的15株细菌对二氯喹啉酸的降解率。图4为本专利技术实施例2筛选的5株真菌对二氯喹啉酸的降解率。图5为本专利技术实施例3筛选的菌株对秸秆的降解能力。图6为本专利技术实施例4筛选的细菌对重金属镉的去除能力。图7为本专利技术实施例4筛选的真菌对重金属镉的去除能力。图8为现有液相富集法的筛选流程。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例采用的循环流化式筛选与驯化装置的结构示意图如图1所示，包括流化床体4、气泵5和蠕动泵6。为了方便观察流化态情况，保证光照，流化床体4采用透明的有机玻璃制成，如需避光培养，可用覆盖物遮住进行。流化床体4为圆柱体，内部空间利用率高，可节约放置空间，如图5所示。流化床体4的上部和下部分别配合有出液器7和进液器8，出液器7上设有出液口(图中未标)和排气口/取样口1，出液口与蠕动泵6连接。进液器8上设有两个接口，分别与气泵5和蠕动泵6连接，流化床体4内细小固体土壤颗粒与液体构成浆态，通过气泵5通气使气速大于颗粒的自由沉降速度下，颗粒被气体带出，气体与固体分离后，土壤固体颗粒物通过蠕动泵6以流态化状态循环流动。出液器7和进液器8与流化床体4之间均设有多孔筛板2，且出液器7与多孔筛板2之间、多孔筛板2与流化床体4之间、以及多孔筛板2与进液器8之间均设有密封垫片3，以加强多孔筛板2与流化床体4的契合。其中，设于流化床体4与进液器8之间的多孔筛板2的上部设有纱布(图中未示)，用来阻挡细沙流入底部，堵塞小管口影响流通与蠕动。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种土壤功能性微生物筛选方法，在循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置中进行，包括如下步骤：/nS1、在流化床体内填充供试土壤；/n所述供试土壤为受污染的土壤；/nS2、先开启所述气泵，后通过蠕动泵加入液体培养基；在所述气泵通入的气体的作用下，所述供试土壤中的固体颗粒被带出，所述气体与所述固体颗粒分离后，在所述蠕动泵的作用下以流态化状态循环流动；/nS3、定期取样，并分别涂布于固体培养基上进行培养，经分离、提纯得到单菌落，即实现对土壤中功能性微生物的筛选；/n所述循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置的结构如下：/n包括所述流化床体、所述气泵和所述蠕动泵；/n所述流化床体的上部和下部分别配合有出液器和进液器，所述出液器和所述进液器与所述流化床体之间设有多孔筛板；/n所述出液器上设有出液口和排气口/取样口；/n所述进液器上设有两个接口，分别与所述气泵和所述蠕动泵连接，所述蠕动泵的入口与所述出液口连接。/n

【技术特征摘要】
1.一种土壤功能性微生物筛选方法，在循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置中进行，包括如下步骤：
S1、在流化床体内填充供试土壤；
所述供试土壤为受污染的土壤；
S2、先开启所述气泵，后通过蠕动泵加入液体培养基；在所述气泵通入的气体的作用下，所述供试土壤中的固体颗粒被带出，所述气体与所述固体颗粒分离后，在所述蠕动泵的作用下以流态化状态循环流动；
S3、定期取样，并分别涂布于固体培养基上进行培养，经分离、提纯得到单菌落，即实现对土壤中功能性微生物的筛选；
所述循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置的结构如下：
包括所述流化床体、所述气泵和所述蠕动泵；
所述流化床体的上部和下部分别配合有出液器和进液器，所述出液器和所述进液器与所述流化床体之间设有多孔筛板；
所述出液器上设有出液口和排气口/取样口；
所述进液器上设有两个接口，分别与所述气泵和所述蠕动泵连接，所述蠕动泵的入口与所述出液口连接。


2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：步骤S1之前，对所述循环流化式土壤功能微生物快速筛选与驯化装置进行灭菌处理。


3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于：步骤S1中，所述液体培养基为常规的无机盐培养基，配方如下：
NH4NO31.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，N...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亚奎，卢滇楠，郑瑾，杜显元，
申请(专利权)人：清华大学，中国石油集团安全环保技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11