一种微生物酶制剂的制备方法技术

一种微生物酶制剂的制备方法，特别是提供一种细菌液体发酵法制备微生物酶制剂的方法，采用膜浓缩过滤的方法，并加入洗涤液除去发酵液中的小分子可溶性杂质和无机盐，再经过匀浆破壁、分离提纯及冻干，得到相应的粗制酶制剂或精制酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物酶制剂的制备方法
本专利技术涉及酶工程
，特别是提供了一种微生物酶制剂的制备方法。
技术介绍
酶是由活细胞产生的，对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质。酶作为一种生物催化剂，具有高效性、专一性、反应条件温和等特点，广泛应用于食品、纺织、医药卫生、能源开发、环境工程、化工等各个生产领域。酶的种类繁多，来源及用途各不相同，因而对酶制品的纯度要求也不同。工业上用酶有的只需要粗制品，一般无需高度纯化，如洗涤剂用的蛋白酶，只需经过简单的提取分离即可。食品工业用酶，则需经过适当的分离纯化，以确保安全和卫生。医药用酶，特别是注射用酶及分析测试用酶，则需要经过高度的分离纯化过程。酶的制备主要有两种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。早期酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取获得。由于动植物生长周期长，有受地理、气候和季节等因素的影响，原料来源受到限制，一般不适用于大规模工业化生产。目前，人们越来越多地转向以微生物作为酶的主要来源。采用微生物发酵法制备酶，具有很多优势：①微生物种类繁多，几乎自然界中存在的所有酶，都可以在微生物中找到。②微生物生长繁殖快，生活周期短，因而酶的产量高。③用于培养微生物的原料来源丰富，价格低，酶的制备成本低。④可以通过诱变等方法培育出高产菌种。⑤结合基因工程、细胞工程等现代生物技术手段，可以完全按照人类的需要使微生物产出目的酶。由于微生物发酵法生产酶具有以上独特优点，目前工业上使用的酶制剂，绝大多数来自于微生物，如淀粉酶类的α一淀粉酶、β一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及异淀粉酶等都是从微生物中生产的。尽管微生物发酵法生产酶制剂存在上述优点，但仍存在一些问题需要解决。①消除毒性：微生物发酵法生产的酶制品中会带有一些细菌自身的生理活性物质，这些生理活性物质往往对人体有害，因此需要更高的分离纯化技术以保证安全。②优良产酶菌种的筛选培育：大多数工业微生物制酶生产采用的菌种较少，目前仅局限于11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，才可能使越来越多的酶采用微生物发酵法进行工业化生产。酶的微生物发酵生产方式有两种，一种是固体发酵法，另一种是液体发酵法。固体发酵法是利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷糠、豆饼等，加水搅拌成半固体状态，供微生物生长和产酶，主要用于真菌来源的商业酶的生产。其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在中国和日本已有悠久的历史。液体发酵法又分液体表面发酵和液体深层发酵法两种。其中液体深层发酵法是现在普遍采用的方法。以细菌为来源的酶的工业化生产均采用此种方法。细菌液体发酵法得到的细菌培养液，多采用离心设备分离菌体，如专利CN110527673A葡萄糖脱氢酶的制备方法中基因工程菌（大肠杆菌）培养液通过离心设备分离菌体。专利CN110819610A极耐热甘露聚糖酶基因工程菌（大肠杆菌BL21）培养液采用离心收集菌体，专利CN108315315A制备阿魏酸脱羧酶的方法，将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养，得细胞培养液，离心，制得菌体细胞。使用离心设备处理微生物培养液的方法适用于实验室小规模处理，工业放大规模比较困难，操作复杂，收率低，具有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种微生物酶制剂的制备方法，特别是提供一种细菌液体发酵法制备微生物酶制剂的方法，采用膜浓缩过滤的方法，并加入洗涤液除去发酵液中的小分子可溶性杂质和无机盐，再经过匀浆破壁、分离提纯及冻干，得到相应的粗制酶制剂或精制酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。本专利技术采取以下技术方案：一种微生物酶制剂的制备方法，包括以下步骤：第一步，微生物培养液经过膜浓缩处理，得到初步菌体浓缩液；第二步，初步菌体浓缩液中加入洗涤液进行洗滤，继续经过膜浓缩处理，得到纯化菌体浓缩液；第三步，纯化菌体浓缩液匀浆破壁，得到粗酶溶液；第四步，粗酶溶液进行分离提纯，得到精制酶溶液；第五步，粗酶溶液或精制酶溶液进行干燥处理，得到对应的粗制酶制剂或精制酶制剂。以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式膜、平板膜、卷式膜或中空纤维膜，所用膜的材质包括金属膜、陶瓷膜、有机膜或其它无机膜，所用膜的分离精度为0.005-0.2微米之间或者膜的切割分子量为10-500kD之间。作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为有机管式膜、无机管式膜、有机平板膜或无机平板膜，所用膜的分离精度为0.01-0.2微米之间或者膜的切割分子量为100-500kD之间。作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式金属烧结膜、管式陶瓷膜或管式有机烧结膜，所用膜的分离精度为0.05-0.2微米之间或者膜的切割分子量为150-500kD之间。以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为水、无机盐溶液或有机盐溶液中的任意一种或两种或两种以上的组合。作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为水或纯水。作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为质量百分比浓度为0.2-1.0%的氯化钠溶液或者pH范围为2-12之间的pH缓冲液。以上方法得到的粗酶溶液可以直接用于工业生产。也可以将粗酶溶液直接干燥处理，得到粗酶制剂，用于环保、日化等对酶纯度要求不高的行业使用。还可以将粗酶溶液进行分离提纯及干燥处理，得到高纯度酶制剂，用于医疗诊断等行业使用。以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，适用于微生物发酵法制备微生物酶制剂，同时也适用于直接提取法从植物或动物细胞提取酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。具体实施方式以下结合实例进一步说明本专利技术的具体实施方式。实施例1某酶发酵液100升，菌体含量（体积比）11.5%，首先用过滤精度为50纳米陶瓷膜浓缩至50升，然后加入2倍体积的工艺水进行洗滤，最后再浓缩至40升，得到的菌体浓缩液中菌体含量27.7%（体积比）。将该菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。测试该粗酶溶液酶活为22.3u/ml。实施例2某酶发酵液100升，菌体含量（体积比）11.5%，首先用过滤精度为50纳米陶瓷膜浓缩至50升，然后加入2倍体积的质量百分比浓度为0.9%氯化钠溶液进行洗滤，最后再浓缩至40升，得到的菌体浓缩液中菌体含量28.2%（体积比）。将该菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。测试该粗酶溶液酶活为23.9u/ml。实施例3某酶发酵液100升，菌体含量（体积比）11.5%，首先用过滤精度为50纳米陶瓷膜浓缩至50升，然后加入2倍体积的pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液进行洗滤，最后再浓缩至40升，得到的菌体浓缩液中菌体含量28.5%（体积比）。将该菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。测试该粗酶溶液酶活为25.7u/ml。...

【技术保护点】
1.一种微生物酶制剂的制备方法，包括以下步骤：/n第一步，微生物培养液经过膜浓缩处理，得到初步菌体浓缩液；/n第二步，初步菌体浓缩液中加入洗涤液进行洗滤，继续经过膜浓缩处理，得到纯化菌体浓缩液；/n第三步，纯化菌体浓缩液匀浆破壁，得到粗酶溶液；/n第四步，粗酶溶液进行分离提纯，得到精制酶溶液；/n第五步，粗酶溶液或精制酶溶液进行干燥处理，得到对应的粗制酶制剂或精制酶制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种微生物酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步，微生物培养液经过膜浓缩处理，得到初步菌体浓缩液；
第二步，初步菌体浓缩液中加入洗涤液进行洗滤，继续经过膜浓缩处理，得到纯化菌体浓缩液；
第三步，纯化菌体浓缩液匀浆破壁，得到粗酶溶液；
第四步，粗酶溶液进行分离提纯，得到精制酶溶液；
第五步，粗酶溶液或精制酶溶液进行干燥处理，得到对应的粗制酶制剂或精制酶制剂。


2.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式膜、平板膜、卷式膜或中空纤维膜，所用膜的材质包括金属膜、陶瓷膜、有机膜或其它无机膜，所用膜的分离精度为0.005-0.2微米之间或者膜的切割分子量为10-500kD之间。


3.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为有机管...

【专利技术属性】
技术研发人员：李君占，
申请(专利权)人：北京鑫佰利科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11